PTENP1作为ceRNA调控PTEN表达及介导肝癌EGFR抑制剂耐药的机制研究

The regulatory mechanism of PTEN in tumors is a current research focus. New research shows that PTENP1 is not encoded protein，but involved in post-transcriptional regulation of PTEN/Akt pathway by competitively binding targeting miRNAs.Our preliminary studies indicate that PTEN has been shown to play the dominant role as a tumor suppressor by negatively modulating the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt pathway and abnormal activation of Akt pathway mediated resistance to EGFR inhibitors for hepatocellular carcinoma. We speculate that PTENP1 is involved in regulation of PTEN/Akt pathway by comptitively binding targeting miRNAs and mediated resistance to EGFR inhibitors for hepatocellular carcinoma.To investigate these mechanisms, we firstly will analyze the expression of PTENP1-PTEN-miRNA and their correlation. Secondly, we will confirm that PTENP1 is involved in post-transcriptional regulation of PTEN as ceRNA by gene transfection, qPCR, immunofluorescence, miRNA functional analysis and dual-luciferase reporter assay in hepatocellular carcinoma cell line and nude mice model. Thirdly, in vivo and in vitro,we will observe the effect of PTENP1 on the hepatocellular carcinoma biological behaviors, analyze the mechanism of PTENP1 regulation of Akt pathway, and explore the role of PTENP1 on resistance to EGFR inhibitors for hepatocellular carcinoma,which will support new theoretical and experimental basis for treatment of hepatocellular carcinoma.

PTEN在肿瘤中的调控机制是目前的研究热点。最新研究表明，PTEN的假基因PTENP1可以和PTEN竞争性结合miRNAs，调控PTEN/Akt信号通路。结合本课题组前期研究，PTEN拮抗Akt通路发挥抑制肝癌的效应，同时异常激活的Akt通路介导肝癌对EGFR抑制剂耐药。因此我们推测，PTENP1通过竞争性结合miRNAs参与PTEN/Akt通路调控并介导肝癌EGFR抑制剂耐药。本项目拟在肝癌标本中检测PTENP1、PTEN及miRNAs的表达水平并分析相关性；在肝癌细胞及裸鼠模型中通过基因转染、qPCR、免疫荧光、miRNA功能分析、报告基因实验探讨PTENP1作为ceRNA参与PTEN转录后调控的分子机制；在体内外实验中观察PTENP1对肝癌恶性生物学行为及PTEN/Akt信号通路的影响，进一步阐明这一新的调控机制在肝癌EGFR抑制剂耐药中的作用，为肝癌治疗提供新的理论基础和实验依据。

PTEN作为PI3K/Akt通路的重要抑癌基因，其表达缺失或下调是HCC发生和发展的重要分子事件。近年来，microRNA通过转录后调控引起靶基因表达缺失或丰度下调的作用模式受到越来越多的重视。本研究以与PTEN相关的miR——miR32和miR155作为研究对象，以PI3K/Akt信号通路为主轴，HCC发生发展和耐药的发生作为本研究的2个方向。在miR32引起HCC耐药发生的研究中，首先检测miR32在肝癌5-Fu耐药细胞株中为高表达而PTEN为低表达；然后构建裸鼠皮下移植瘤模型并在模型和HCC临床病理资料中检测相关分子的表达，明确miR32和PTEN表达的相关性；利用双荧光素酶报告基因实验验证miR32和PTEN的靶向性，再转染miR32干预剂、PTEN小干扰RNA、过表达PTEN质粒，以及使用PI3K/Akt通路抑制剂WM，利用real-time PCR和western blot验证miR32和PTEN的关系；随后通过MTT从功能方面证实miR32靶向PTEN引起HCC耐药发生；最后从PTEN下游分子出发探讨了miR32-PTEN-PI3K/Akt通过EMT作用诱导HCC耐药发生。在miR155促进HCC发生发展的研究中，首先利用real-time PCR在DEN-诱导大鼠HCC模型、HCC临床病理资料和HCC细胞中检测miR155和PTEN和的表达极其相关性；利用双荧光素酶报告基因实验验证miR155和PTEN的靶向性，再通过转染miR155干预剂、PTEN小干扰RNA、过表达PTEN质粒以及使用WM，利用real-time PCR和western blot间接印证miR155和PTEN的关系；接着验证miR155通过靶向PTEN异常激活PI3K/Akt通路促进HCC细胞增殖、侵袭和迁移，并抑制凋亡；通过western blot检测PTEN下游分子与凋亡和侵袭迁移相关分子的表达变化，确定miR155能促进HCC发生发展。通过本研究我们得出结论：1、miR32通过靶向PTEN异常激活PI3K/Akt引起EMT作用，诱导HCC多药耐耐药的发生；2、miR155靶向PTEN导致PI3K/Akt通路过度激活，促进HCC发生发展。我们阐明了PTEN相关miR在HCC发生发展和耐药发生中的重要作用及机制，为寻找HCC治疗的新靶点提供理论依据。