ox-LDL介导BKCa通道磷酸化在高胆固醇诱发兔SOD形成中的作用

SO张力增高是高胆固醇兔SOD产生的病理学基础，BKca通道活性降低导致细胞内钙离子超载是SO张力增高的根本原因。我们前期研究显示SO细胞BKca通道基因及蛋白表达无变化，活性下调可能与通道蛋白的磷酸化修饰有关。相关研究发现ox-LDL作为胆固醇代谢紊乱中重要的毒性物质可介导BKca通道磷酸化使血管张力增加。兔SO细胞BKca通道蛋白预测及预实验提示并证明其表面存在丝氨酸/苏氨酸磷酸化位点。但ox-LDL导致SO细胞BKca通道磷酸化机制及其在SOD形成中的作用未见报道。故本项目拟以BKca通道磷酸化为切入点，采用免疫组化、蛋白印迹、单通道膜片钳、激光共聚焦及药物干预等方法，从细胞及大体动物水平研究ox-LDL介导SO细胞BKca通道磷酸化途径，探讨上述途径在高胆固醇兔SOD形成中的作用，为早期防治胆固醇代谢紊乱性SOD提供新思路，为胆固醇代谢紊乱相关疾病发生机制研究提供新策略。

研究背景 Oddi括约肌（Oddi sphincter，SO）张力增高是高胆固醇兔Oddi括约肌功能紊乱（Dysfunction of Oddi sphincter，SOD）产生的病理学基础，我们前期研究显示外向的大电导钙激活型钾离子通道（large conductance, calcium-activated potassium channel, BKca）活性降低导致细胞内钙离子超载是SO张力增高的根本原因。SO细胞BKca通道基因及蛋白表达无变化，活性下调可能与通道蛋白的磷酸化修饰有关。ox-LDL是胆固醇代谢紊乱中重要的毒性物质，ox-LDL介导BKca通道磷酸化使血管张力增加。方法 本项目以BKca通道磷酸化为切入点，采用RT-PCR和免疫印迹法、免疫沉淀检测HC兔SO细胞BKca通道的mRNA和蛋白表达量； BKca通道蛋白苏氨酸、丝氨酸和酪氨酸残基的磷酸化水平。ox-LDL与SO细胞共培养测定PKA/PKG/PKC的活性并鉴定在此过程中发挥作用的相关激酶。采用离体肌环张力实验，检测BKca通道蛋白丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基的磷酸化/脱磷酸化状态与SO肌张力调节的关系；PKA、PKC、PKG相关磷酸化通路活化与SO张力调节间的关系。结果：HC兔SO细胞BKca通道α和β1亚基的mRNA和蛋白的表达无明显变化；高胆固醇兔血清中ox-LDL明显升高， BKca通道蛋白的磷酸化水平发生异常改变：α亚基苏氨酸和酪氨酸残基的磷酸化水平明显降低，丝氨酸残基的磷酸化水平明显增加。β1亚基的苏氨酸残基的磷酸化水平无明显改变；SO细胞CaM的蛋白及基因、氨基酸序列表达及CaMK11无明显改变，p-CaMKⅡ的活性却明显增加。PKC激动剂可引起对照组SO收缩，而PKC/PKA抑制剂不能缓解对照组及高胆固醇组的SO收缩反应；PKA激动剂对SO收缩作用弱，对照组及高胆固醇组间无明显差别；PKG激动剂可引起高胆固醇组SO明显收缩，而在对照组无此作用，PKG抑制剂可引起对照组及高胆固醇组舒张。结论：高胆固醇兔血清中ox-LDL明显升高并导致 BKca通道蛋白的磷酸化水平发生异常改变，进而引起SOD形成；在对照组中，丝氨酸磷酸化是PKC调节SO张力的主要位点，在高胆固醇组中，丝氨酸磷酸化是PKA调节SO张力的主要位点，苏氨酸磷酸化是PKG诱导对照组及高胆固醇组舒张的重要位点，PKG通