双向途径联合诱导喉癌细胞凋亡的靶向性基因治疗研究

在喉癌基因治疗中，如何高效且特异地诱导肿瘤细胞凋亡是亟待解决的关键问题。本研究在前期工作成功克隆喉癌相关特异性启动子、凋亡诱导基因活化型caspase-3（可直接诱导细胞凋亡而无须经上游分子活化）及合成针对EGFR的人工microRNA的基础上，拟通过选择的喉癌相对特异性启动子靶向性调控目的基因的表达，从直接诱导凋亡和抑制抗凋亡基因两条途径联合诱导喉癌细胞凋亡。本研究拟采用在喉鳞状细胞癌细胞株Hep-2中特异性转录效率较高的启动子靶向性调控活化型caspase-3和针对EGFR的人工microRNA在喉鳞状细胞癌中表达，通过构建重组腺病毒载体，达到靶向性诱导喉癌细胞凋亡的目的，以期寻找一种新型、安全、高效的喉鳞状细胞癌基因治疗策略。

在喉癌基因治疗中，如何高效且特异地诱导肿瘤细胞凋亡是亟待解决的关键问题。本研究在前期工作成功克隆喉癌相关特异性启动子、凋亡诱导基因活化型caspase-3（可直接诱导细胞凋亡而无须经上游分子活化）及合成针对EGFR的人工microRNA的基础上，拟通过选择的喉癌相对特异性启动子靶向性调控目的基因的表达，从直接诱导凋亡和抑制抗凋亡基因两条途径联合诱导喉癌细胞凋亡，以期寻找一种新型、安全、高效的喉鳞状细胞癌基因治疗策略。. 本研究通过Luciferase Assay筛选到SLPI作为喉癌组织特异性启动子，同时成功合成针对EGFR的人工microRNA，与前期合成的活化型Caspase-3依次克隆到pDC312载体，并与pBHGlox (delta)E1,3Cre质粒共转染HEK293细胞，完成病毒包装，体内外试验显示： Ad- SLPI-EGFRamiR-SLPI-revCasp3 病毒作用 72 小时的 Hep-2 细胞，32kd 酶原形式的 Caspase-3 减少，而 17kd 活化型 Caspase-3 表达显著增高，EGFR蛋白水平明显下调。MTT及流式细胞仪检测显示SLPI-EGFRamiR-SLPI-revCasp3能有效抑制Hep-2细胞增殖，有效诱导凋亡，且与DDP合用可显著增强抑制Hep-2细胞增殖作用。体内试验进一步证实Ad-SLPI- EGFRamiR-SLPI-revCasp3病毒瘤内注射可使肿瘤体积及瘤重明显降低，肿瘤的葡萄糖代谢活性亦显著降低。. 综上，本课题成功构建Ad-SLPI-EGFRamiR-SLPI-revCasp3重组病毒，该病毒可在喉癌Hep-2细胞中特异性表达活化型Caspase-3,显著下调EGFR的蛋白表达水平，实现双向特异性的诱导喉癌细胞凋亡，体内外实验显示重腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR-SLPI-revCasp3能有效抑制喉癌细胞的生长和诱导细胞凋亡，且呈剂量相关，与 DDP 合用可提高抑瘤作用。