基于荧光素酶-免疫捕获法的虫媒病毒快速血清学诊断新技术研究

Serologic method cannot be erased for its important function in pathogen infection inspection and vaccine evaluation, but only ELISA and colloid gold are available in clinic for antibody detection. We are developing a novel serology detection method, luciferase immuno capture technique(Luc-IC).This technique utilize eukaryon system to express antigen, which can retain the natural conformation and bind to antibody sensitively and specially; use luciferase as detecting marker, which is more sensitive and can realize quantitative detection; the protocol is similar to immunoprecipitation ,which is time saving. Possessing the advantage of sensitive, quantitative and rapid, this technique is highly potential in clinic，but some difficulties exist. In this project, we take dengue virus, Japanese encephalitis virus and tick borne encephalitis virus as target viral pathogens, devote to solving the problems including select sensitive and specific antigen fragment, simplify the antigen preparation protocol, and improve stability of luciferase. Finally，establish a rapid, sensitive and stable technique of Luc-IC, meanwhile, produce available serologic kits for JEV,TBEV and DENV detection. This work can produce techniques possessing independent intellectual property right, and may be helpful for other pathogens serology kits developing.

血清学技术在病原体感染检测、疫苗效果评价中具有不可替代的作用。目前,临床可用的血清抗体检测技术仍是ELISA和胶体金。我们探索了一种新型的抗体检测技术-基于荧光素酶的免疫捕获检测技术（Luc-IC），该技术采用真核系统进行抗原表达，保证抗原的天然空间构象以利于与抗体的特异结合；以荧光素酶作为检测标记物，敏感性高，可进行定量分析；实验过程与免疫沉淀相似，耗时短。该技术综合了快速、灵敏、可定量分析的特点和优势，具有很好的临床应用前景，但尚有技术瓶颈需要克服。本项目拟以我国流行的登革病毒、乙型脑炎病毒、蜱传脑炎病毒为研究对象，以筛选获得灵敏特异的检测抗原、简化抗原制备策略、提高荧光素酶稳定性为拟解决的关键技术，建立起快速、灵敏、稳定的Luc-IC血清检测系统，制备三种虫媒黄病毒感染的快速检测试剂。本课题的开展可形成具有自主知识产权的核心技术，还可为其他病原体的快速血清学检测提供重要的技术支撑。

本研究以三种重要的虫媒黄病毒为检测对象，包括蜱传脑炎病毒，登革病毒1-4型，以及乙型脑炎病毒，建立一种新型的血清学检测方法--基于荧光素酶的免疫捕获技术（Luc-IC），从而为病毒感染的检测及免疫效果评价提供简便灵敏的技术手段。 在抗原的选择上，使用筛选出的3种黄病毒特异性的E蛋白片段；在抗原的表达形式上，以构建真核分泌型稳定表达细胞系进行表达，以保持抗原的天然构象，并利于抗原的大量制备。. 同时，为了提高荧光素酶活性进而提高检测灵敏度，本研究对荧光素酶的表达进行改进。综合比较目前使用较多的几种荧光素酶：萤火虫荧光素酶、海肾荧光素酶、Gaussia荧光素酶及NanoLuc荧光素酶，选取信号强度更高、结构更稳定NanoLuc荧光素酶替代目前所用的海肾荧光素酶，并构建了分泌性表达荧光素酶重组抗原的质粒，制备完成了蜱传脑炎病毒、乙型脑炎病毒和登革病毒的荧光素酶重组抗原，构建了表达抗原的稳定细胞系。抗原的荧光强度可达109/ml。并优化了荧光素酶-免疫捕获法的检测过程，从而提高了检测灵敏度。进而收集临床样本，通过对临床样本的检测，评价了该重组抗原及检测方法的特异性及灵敏性。特异性100%，灵敏性达96%，明显高于目前临床广泛使用的普通ELISA和免疫荧光方法。本方法操作简便,有望成为新一代的虫媒病毒血清学检测方法。该方法的建立不仅可为虫媒黄病毒抗体的血清学调查、病原体与疾病的关系确认提供新的技术手段，也可为其它病毒的抗体谱筛查提供借鉴，或作为疫苗效果的评价手段，对病毒病的有效预防和控制具有重要的意义。