ANRIL-INK4通路介导葡萄膜黑色素瘤转移的机制研究

As the most common malignant intraocular tumor in adults, uveal melanoma (UM) is life-threatening and has a high rate of metastatic mortality, with poorly-studied pathogenesis. The classic UM mechanism of occurrence focuses on gene mutations and chromosomal abnormalities. Recent studies have shown that long non-coding RNA (lncRNA) plays an important role in the metastasis of UM. Our previous study showed that lncRNA ANRIL located at p21.3 locus of chromosome 9 was abnormally high expressed in UM. Knockdown of ANRIL could significantly inhibit the growth and metastasis of UM and INK4 may serve as the target gene. However, mechanism of how ANRIL-INK4 regulates the metastasis of UM remains unknown. Therefore, we propose to clarify the key role of ANRIL-INK4 in UM metastasis using DNA affinity purification (DAPA), chromosome oligonucleotide -affinity precipitation (ChOP)，and chromatin immunoprecipitation (ChIP) and aim to provide potential target for UM treatment.

葡萄膜黑色素瘤（Uveal Melanoma，UM）是成人最常见的眼内恶性肿瘤，转移率高，死亡率高，严重危害人民健康。近来研究发现，长非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在UM转移中扮演重要角色。本课题组前期研究发现，位于9号染色体p21.3位点的ANRIL lncRNA在UM中异常高表达，敲减ANRIL可显著抑制UM的生长和转移，INK4可能为潜在靶点。然而，ANRIL-INK4通路调控UM转移的机制有待深入研究。因此，本项目拟采用DNA亲和洗脱（DAPA）、染色体寡核苷酸沉淀实验（ChOP）、染色质免疫沉淀（ChIP）等表观遗传技术，明确UM转移中ANRIL介导INK4启动子区表观修饰状态及关键修饰因子，揭示关键修饰因子在UM转移中的作用，从而阐明ANRIL-INK4通路调控UM转移的机制，为肿瘤转移治疗提供新靶点。

眼部黑色素瘤是成人最常见的眼部恶性肿瘤之一，转移率高，死亡率高，严重危害人民健康。本项目前期研究采用HTA2.0芯片筛选发现，UM组织中差异表达的lncRNA，其中ANRILlncRNA显著高表达，另外高表达的lncRNA还包括PAUPAR、CANT-1、LINC-PINT。我们构建ANRIL敲除细胞株，发现ANRIL敲低后靶蛋白INK4表达升高，同时UM细胞转移能力增强。发现 ANRIL在介导INK4 眼部黑色素瘤转移的调控机制由PRC2复合体EZH2主要参与完成，该调控通路中的EZH2在皮肤黑色素瘤中已陆续被证实为关键因子，因此我们研究在脉络膜黑色素瘤转移过程中EZH2是否作为关键节点介导多组lncRNA调控下游靶向。通过RNA-FISH及Cell nuclear/cytoplasmic fraction分析发现，LINC-PINT的表达主要集中在细胞核内。并验证lncRNA通过EZH2表观修饰和抑制INK4簇表达等多靶点途径参与到UM的转移调控中。另一方面，调整思路，增加全基因组对眼黑色素瘤进行转录组学研究，利用类似的研究思路，将其与m6A相关突变基因取交集，发现reader基因YTHDC2 c.1889C>T(p.P630L) 突变频率17.53%。随后在21例CM患者肿瘤组织中YTHDC2的表达。免疫荧光染色检测不同预后患者的肿瘤中YTHDC2表达不同，进而利用转录-蛋白组联合测序手段，也开展了靶向基因测序筛选、RNA 甲基化、长非编码 RNA等研究阐明了眼部黑色素瘤中存在一系列表观调控现象。