过表达拟南芥PAP1转录因子高效调控丹酚酸B生物合成的分子机理研究

丹酚酸B是丹参重要的药效成分。我们发现用拟南芥PAP1转录因子转化丹参可使丹酚酸B含量显著提高，参与其合成的酶基因表达水平也明显上调，但PAP1调控的靶基因尚不清楚，其转录激活的分子机理也不明确。借鉴拟南芥中的研究，我们推测丹参中丹酚酸B的合成存在【PAP1+转录共激活因子协同作用→关键酶/靶基因表达增强→丹酚酸B合成速率提高】这样一种调控模式。本研究采用基因瞬时表达、DNA 酶I足迹法和凝胶迁移法研究PAP1对丹酚酸B合成相关酶基因(PAL、C4H、4CL、TAT、HPPR)表达的激活作用，确定其靶限速酶；同时通过酵母双杂交系统筛选PAP1可能的转录共激活因子，明确两者协同作用促进转录增强的特性；进而利用该调控机制在丹参中共表达PAP1及其转录共激活因子，获得丹酚酸B含量进一步提高的优异株系。研究结果为丹参丹酚酸B生物合成的分子机制提供资料，为药用植物次生代谢产物调控和分子育种奠定基础。

通过该课题的研究，我们发现拟南芥PAP1转录因子转化丹参可使丹酚酸B含量显著提高，结合表达谱和代谢组数据分析了过表达PAP1株系中显著变化的标志性代谢产物和差异表达基因，结果表明，PAP1转录因子通过激活苯丙烷代谢途径中PAL、C4H、4CL、RAS和酪氨酸代谢途径中TAT基因的表达，促进了酚酸类物质的合成积累，但并不影响丹参酮类化合物的含量，我们确定了丹酚酸B生物合成存在【PAP1转录因子调控→PAL等关键酶基因表达→丹酚酸B积累】这样一种调控模式；该课题进一步构建了丹参的酵母双杂交文库，以PAP1为诱饵，初步筛选出20余个可以和PAP1发生作用的cDNA 编码蛋白，包括在其他植物中被认为常常与PAP1成对发挥转录激活作用的一个bHLH（basic Helix-Loop-Helix）类转录因子，命名为SmMYC，推测两者协同作用促进转录增强。在此基础上，获得了SmMYC的基因全长，进一步利用酵母双杂交、Luciferase互补实验对拟南芥PAP1和SmMYC的作用关系进行了验证，并对SmMYC的表达特性进行了分析。在拟南芥PAP1过表达转基因丹参中，SmMYC的表达也显著提高，拟南芥PAP1可能既作为SmMYC的转录激活子正向调控其表达，同时又与SmMYC形成转录复合体共同调控酚酸类成分的合成。该研究结果为丹参丹酚酸B生物合成的分子机制提供了资料，为药用植物次生代谢产物调控和分子育种奠定了基础，完成了项目的预期研究目的。. 在本课题的资助下，共发表研究论文6篇，其中SCI收录论文4篇，国内核心论文2篇；申请并授权发明专利1项；培养博士研究生1名，硕士研究生2名。