犀角地黄汤阻抑TNFα-TNFR p55通路治疗急性肝损伤的机制研究

TNFα-TNFR p55信号通路是急性肝损伤中肝细胞凋亡、坏死的优势通路，抑制TNFα的生成和TNFα-TNFR p55信号通路是治疗急性肝损伤的两大关键环节。申请人在前期研究中证明，解毒凉血活血代表方犀角地黄汤不影响LPS/GaIN诱导急性肝损伤小鼠血清TNFα水平，但可明显降低死亡率，提示犀角地黄汤不通过影响TNFα生成的上游通路而发挥治疗作用。由此我们提出"犀角地黄汤通过抑制TNFα-TNFR p55下游信号通路治疗急性肝损伤"的假说。本项目拟在三种急性肝损伤动物模型中验证犀角地黄汤及其拆方治疗急性肝损伤的疗效，并通过体外实验研究该方及其关键药物对TNFα-TNFR p55下游的Caspase级联反应通路及NF-κB信号通路的影响，探讨其分子作用机制，阐明作用靶点，为解毒凉血活血法治疗急性肝损伤、降低病死率提供理论和实验依据。

本研究项目按照计划进行，并完成研究内容。目前发表SCI论文3篇，中文核心期刊论文7篇，培养4名研究生和1名中青年学术带头人，并取得如下重要进展：（1）犀角地黄汤在LPS/D-GalN急性肝衰竭模型和TNF-α/D-GalN急性肝衰竭小鼠模型中均有显著的保肝作用。表现为：明显提高造模小鼠24小时生存率、降低血清转氨酶水平、改善肝脏组织病理学损伤，而对小鼠血清中炎性因子（如TNF-α、IL-6）、抑炎因子IL-10及巨噬细胞趋化因子MCP-1的水平无影响。在TNF-α/D-GalN急性肝衰竭小鼠模型中，犀角地黄汤亦能明显减少肝细胞凋亡率。（2）犀角地黄汤的关键药物是生地。犀角地黄汤由水牛角、生地、赤芍及丹皮四味药物组成。生地能显著提高LPS/D-GalN模型及TNF-α/D-GalN模型小鼠的24小时生存率，其余的三味药物均无此作用。生地的有效单体为半乳糖。首先证实有效单体结构稳定和（或）含量较高。接着阐明地黄的有效成分既溶于水也溶于乙醇中。最后半乳糖而非其他糖类和环烯醚萜类阻抑小鼠免受LPS/D-GalN 或 TNF-α/D-GalN 诱导的急性肝损伤。（4）半乳糖的保肝作用表现在：半乳糖能显著提高模型小鼠的生存率、降低血清转氨酶水平、改善肝脏组织病理学损伤、减少肝细胞凋亡率。（5）半乳糖发挥保肝作用的机制：①半乳糖在体外实验中能抑制肝细胞凋亡,在体内实验中抑制TNF-α/D-GalN造模小鼠肝组织中caspase8的裂解。②半乳糖在体外实验中能提高TNF-α诱导的NF-KB的磷酸化水平。在体内试验中，半乳糖促进TNF-α/D-GalN模型小鼠及TNF-α/ActD模型小鼠肝组织中NF-KB的磷酸化。即半乳糖通过活化NF-KB信号通路抑制TNF-α诱导的肝损伤。③半乳糖对MAPK通路（p38通路、JNK通路及ERK通路）无影响；④半乳糖促进TNF-α/D-GalN 模型小鼠肝组织中抗凋亡基因c-Flip、IAP1、Gadd45β及A20的mRNA的表达。