菲律宾蛤仔凝集素对水产品腐败希瓦氏菌抑制作用机制的研究

Shewanella putrefaciens was specific spoilage organism (SSO) of protein-rich fish, shellfish and crustacean. The growth inhibition of S. putrefaciens was a key way for resolving putrid problem in aquatic products. Using biological bacteriostatic agent could significantly prolong aquatic products shelf life of protein-rich fish, shellfish and crustacean. Therefore, the finding of effective biological preservatives against S. putrefaciens was an important means of resolving putrid problem during processing and storage of aquatic products..Lectin of shellfishes is one of innate immunity factors. It is associated with inhibition activity to microorganisms. Therefore lectins of shellfish were potential sources of biological bacteriostatic agent. Previous studies showed that short-neck clam Ruditapes philippinarum lectin (MCL-T) could inhibit the growth of S. putrefaciens. In this work, on the basic of previous results the effects of R. philippinarum lectins on the membrane and membrane molecules of S. putrefaciens will be investigated. And then proteomics and metabolomics are applied to investigate the mechanism changes of S. putrefaciens after inhibition effect of R. philippinarum lectin. It will lay the foundation for understanding of the mechanism of inhibition of S. putrefaciens and developing biological bacteriostatic agent from shellfish lectins.

腐败希瓦氏菌是鱼、贝类以及甲壳类等富含蛋白质水产品的特定腐败菌。抑制希瓦氏菌是解决水产品加工与贮藏过程中腐败问题的关键之一。利用生物保鲜剂抑制希瓦氏菌，可以显著延长鱼、贝类以及甲壳类等富含蛋白质水产品的货架期。因此，寻找有效的抑制希瓦氏菌的生物保鲜剂是解决水产品加工与贮藏过程中腐败问题的重要手段。.贝类凝集素是其天然免疫因子，通常具有抑制微生物的活性，是一种潜在的抑菌剂来源。前期研究发现了菲律宾蛤仔凝集素对希瓦氏菌产生的抑制作用。本项目拟在前期研究基础上，深入研究菲律宾蛤仔凝集素对希瓦氏菌产生抑制作用的机制，系统地解析出菲律宾蛤仔凝集素与希瓦氏菌细胞膜及膜上分子的相互作用，进而利用蛋白质组技术及代谢组学技术揭示出菲律宾蛤仔凝集素干扰希瓦氏菌代谢途径产生抑制作用的机理。研究结果有助于深入认识凝集素抑制细菌的机理，为获得贝类凝集素类抑菌剂提供基础数据。

为了全面研究菲律宾蛤仔凝集对水产品腐败希瓦氏菌抑制作用机理，研究了MCL在菲律宾蛤仔血淋巴中产生的时间规律以及诱导产生MCL的方法。发现MCL在菲律宾蛤仔体内的含量较少，采用体内注射方式S. putrefaciens方式可以有效诱导其产生MCL。MCL对S. putrefaciens表现出较好的抑制活性，且其抑菌活性具有温度依赖性。用扫描电子显微镜观察MCL作用于S. putrefaciens后，细胞表面变褶皱且出现孔洞，且30℃条件下孔洞数量多于4℃。MCL能破坏菌体的细胞壁和细胞膜，低浓度MCL与S. putrefaciens菌体共培养后，导致其溶解，而高浓度MCL与S. putrefaciens菌体共培养后能凝集菌体并在菌体周围形成一层膜包裹菌体。经MCL处理的S. putrefaciens细胞内Ca2+流失。MCL与S. putrefaciens的膜蛋白（OMP）具有相互作用，MCL与S. putrefaciens OMP的结合受N-乙酰-D-半乳糖酰胺（N-acetyl-D-galactosamine, GalNAc）及猪胃黏蛋白（Mucin from porcine stomach, PSM）的抑制。利用非标记定量蛋白质组学和UHPLC-Q-TOF MS代谢组学方法分析S. putrefaciens细胞在MCL作用6 h后的样品（L组）与正常S. putrefaciens（C组）蛋白表达谱的差异，共鉴定出421个蛋白，其中有74个差异蛋白，16个蛋白表达量上调，58个蛋白表达量下调。蛋白质组学和代谢组学的分析表明，参与氨基酸生物合成途径的磷酸核酶焦磷酸激酶、烯醇化酶的表达量上调，其余10种蛋白表达量下调；参与丙酮酸代谢途径、柠檬酸循环途径、氨基酰-tRNA生物合成途径、碳代谢途径的蛋白表达量均下调。MCL是通过阻碍S. putrefaciens体内氨基酸合成、抑制丙酮酸代谢途径和柠檬酸循环途径等来实现抑菌作用的。MCL对冷藏黄鱼、带鱼、鲶鱼及大菱鲆的保鲜作用研究表明，发现MCL处理组在冷藏期间的菌落总数、pH、TVB-N、TMA-N及TBA值低于对照组，表明MCL对冷藏黄鱼、带鱼、鲶鱼及大菱鲆有一定的保鲜作用。项目共发表论文9篇，其中SCI收录4篇。申报专利1项。毕业博士研究生1人、硕士研究生4人。