补充16S rRNA技术缺陷，建立适合肠道菌群调查的单拷贝基因新型分子标记

16S rRNA biomarker is the most widely used technique of the investigations of intestinal flora, which is closely related to human health. However, the inherent flaw of 16S rRNA gene, such as multiple copies (The copy numbers of Bacteroides, Firmicutes, Proteobacteria are 3.09±1.62, 6.29±3.04, 4.11±2.51 respectively), low resolution, amplification bias and hide sequencing errors, directly impact on the surveys of intestinal flora. It is an important scientific issue of developing a new biomarker to supplement the 16S rRNA techniques under the age of high-throughput data. Many single-copy housekeeping genes have the potential to become such newly biomarker, since occupying the characteristics of single copy / high resolution / sequencing translation detection, etc. Unfortunately, the development of single-copy housekeeping biomarker is still in fancy for intestinal flora. Accordingly, the project intends to develop 1-2 single copy housekeeping biomarker(s) for intestinal flora investigations using bioinformatics technology, under experimental verification, after system analysis compared to16S rRNA gene, with the complementary ability to supplement the inherent flaw of 16S rRNA gene.

肠道菌群与人体健康密切相关，16S rRNA分子标记是肠道菌群研究中应用最广泛的技术；但16S rRNA基因固有的缺陷：如多拷贝（拟杆菌、厚壁菌、变形菌拷贝数分别为： 3.09±1.62、6.29±3.04、4.11±2.51）、低分辨率、扩增偏好性及难以发现的测序错误等，直接影响肠道菌群的调查，发展能补充16S rRNA技术的新型分子标记是高通量数据时代下亟待解决的重要科学问题。诸多单拷贝管家基因，具单一拷贝/具更高分辨率/测序结果的翻译检测等优点，有潜力被挖掘成为该类新型分子标记。遗憾的是，国际上尚无符合肠道菌群调查的此类标记。据此，本项目拟应用生物信息学技术，重点发掘1-2个单拷贝管家基因发展为新型分子标记，并通过实验验证，系统分析新方法与16S rRNA基因所揭示多样性的异同，评估其对16S rRNA基因固有的缺陷的补充作用，以建立能补充16S rRNA固有缺陷的新型分子标记。

肠道菌群与人体健康密切相关，而16S rRNA分子标记是肠道菌群研究中应用最广泛的技术；但16S rRNA基因存在固有的缺陷：如多拷贝、低分辨率、扩增偏好性及难以发现的测序错误等，寻找并发展能补充16S rRNA技术的新型分子标记是高通量数据时代下亟待解决的重要科学问题。本项目主要研究内容和结果如下：1）基于perl编程撰写了基因组下载及分析的脚本，并应用其成功构建本地基因组数据库I和II；2）利用本地基因组数据库I，获得肠道主要菌群的16S rRNA的多拷贝数统计；3）利用本地基因组数据库II对42个功能基因进行了序列提取及分析，从理论上进行了分子标记筛选；4）成功构建人工肠道混合菌群（78株），用于后续验证实验。5）从理论和实验上，验证16S rRNA常用引物存在PCR偏好性；6）逐一分析筛选42个功能基因，设计理论上可用的功能基因引物（recG, gyrA, gyrB, fusA, recA, rpoC），并以人工混合菌群为样品，对不同引物进行组合（>200对），进行了实验验证筛选；7）通过人工混合菌群实验，证实功能基因rpoC基因分子标记对16S rRNA分子标记技术具补充作用；8）探索了基于rpoC功能基因的SRAP技术；9）应用rpoC功能基因分子标记进行近缘肠道菌群鉴别；10）基于rpoC基因新标记展开了肠道菌群多样性调查。综上，本课题已成功构建了可用于肠道菌群分析的基于rpoC基因的检测技术，该技术能互补16S rRNA技术的低分辨率、扩增偏好性等缺陷。