基于雌激素受体信号转导途径研究加减青娥方对绝经后骨质疏松症的防治作用及其机制

Estrogen deficiency of postmenopausal women greatly increased the incidence of osteoporosis and fractures. The current widespread use of hormone replacement therapy has obvious side effects. Natural phytoestrogens as estrogen substitutes has become the study hotspot on treatment of postmenopausal osteoporosis (PMOP), Especially, phytoestrogens in traditional Chinese medicine causes researchers' attention. Preliminary studies showed that: Modified Qing E Formula had obvious estrogen-like effects, significantly increased mineral density of tibia proximal and distal bone.But still lacks the systematical and scientifical study of the formula on the preventive and therapeutic effects and the optimal treatment time on PMOP, and lacks the study of their molecular mechanism and targets. We are intended to: with the combination of in vivo and in vitro studies, from the upstream reasons to PMOP, changes in proliferation and differentiation of osteoblasts and osteoclasts, and the downstream performance of PMOP, changes in bone metabolism biochemical markers and bone mass, bone structure, bone biomechanics, Fully determine the preventive effects of the formula on PMOP; Analysis of the optimal treatment time by studying the different protective effects induced by different dosing cycle; Research the molecular biology mechanism and targets to the preventive and therapeutic effects of Modified Qing E Formula on PMOP based on the classic gene pathway and nongenomic pathway of the ER signalling pathways. So as to provide the experimental evidences for new drugs development and clinical applications of chinese herbs for the prevention and cure of PMOP.

绝经后妇女由于雌激素缺乏而大大增加了骨质疏松和骨折的发生率，广泛使用的激素替代疗法副作用明显，天然植物雌激素作为雌激素的替代物已成为当前防治绝经后骨质疏松症（PMOP）的研究热点，研究显示加减青娥方具有明显的植物雌激素样作用，显著增加胫骨近、远端的骨密度。但仍缺乏系统、科学地研究该方对PMOP的防治作用及最佳用药时间，缺乏其分子作用机制和靶点的研究。本课题拟：通过在体与离体研究相结合，从PMOP形成的上游原因，即成骨细胞和破骨细胞增殖、分化的变化，和骨质疏松症的下游表现，即骨代谢生化标志物及骨量、骨结构、骨生物力学等变化，这两个方面全面判定加减青娥方对PMOP的防治作用；通过不同给药周期对PMOP的防治效果分析以得出最佳用药周期；基于ER信号转导通路中的经典基因途径和非基因途径研究该方防治PMOP的分子生物学机制，明确作用靶点。从而为防治PMOP中药新药的开发与临床应用提供依据。

目前传统治疗骨质疏松的药物主要采用雌激素，降钙素，氟化物，钙剂，维生素D等，虽然在治疗过程中有一定的疗效，但无法避免在治疗中产生的副作用。中医药治疗骨质疏松症因其疗效显著，副作用小，费用低等优点己被逐渐应用于骨质疏松的临床治疗中。本课题采用3月龄雌性SD大鼠双侧卵巢切除建立成年大鼠骨质疏松模型，以雌二醇为阳性对照药物，考察加减青娥方对卵巢切除骨质疏松大鼠的作用。利用全自动生化分析仪测定血清Ca、P、碱性磷酸酶(BALP)等。利用ELISA方法测定血清骨钙素（OC）、血清I型胶原C端肽(CTX-I)和抗酒石酸碱性磷酸酶（TRAP）等指标。采用Micro CT法测定大鼠胫骨近端松质骨骨密度等；取胫骨近端制成不脱钙骨切片进行骨组织形态计量学分析，并考察加减青娥方对大鼠股骨近端ERα mRNA表达和ERα蛋白水平。利用体外培养的小鼠破骨前体RAW264.7细胞作为细胞模型，经RANKL诱导后向细胞中加入不同浓度的加减青娥方提取物，利用荧光定量Real-time RT-PCR法检测RANKL诱导的RAW264.7细胞分化为破骨细胞雌激素受体（ER）mRNA表达；.研究结果显示，与假手术组相比，去卵巢大鼠BALP活性增强，血清骨钙素的量减少。胫骨近端骨密度明显降低，骨小梁数目(Tb.N)减少，骨小梁间隙(Tb.Sp)增加，骨小梁连结减少。加减青娥方能降低血清BALP活性水平，胫骨近端骨密度增加，骨小梁数目增加，骨小梁间隙减小。并能够促进去卵巢大鼠股骨近端ERαmRNA表达和蛋白表达水平，表明加减青娥方具有同雌激素类似的抗骨质疏松活性，通过降低雌激素缺乏导致的骨转化亢进，抑制骨吸收，增加骨强度，改善骨小梁结构。体外研究发现加减青娥方可增加RANKL诱导的RAW264.7细胞分化为破骨细胞ERαmRNA的表达。并可通过调控ERα基因的表达，抑制破骨细胞的分化、增殖，从而实现防治骨质疏松的作用。研究也发现不同浓度的加减青娥方对RANK基因mRNA的表达均有抑制作用，高剂量组的加减青娥方对CTSK基因mRNA的表达有抑制作用，加入雌激素受体抑制剂后这种抑制作用减弱，这种作用与雌二醇（E2）作用相似，而对TRAP基因mRNA的表达抑制作用不明显，提示加减青娥方是通过抑制CTSK、RANK基因mRNA的表达来抑制骨吸收相关因子的表达，从而实现防治绝经后骨质疏松的作用。