具靶向穿膜与内涵体逃逸功能的新型聚酰胺-胺siRNA递送系统的构建及抗肿瘤研究

To solve the problems of low delivery and/or trasfection efficiency existing in siRNA nonviral delivery system, we aim to build a novel and smart siRNA delivery system, with functions of stability in systemic circulation, active tumor targeting, cell penetrating and quick endosomal escape, in order to enhance siRNA delivery and transfection efficiency in targeted cells, promote gene silence and achieve anti-tumor effect. The delivery system is based on PAMAM dendrimers, on the surface of which the histidine(His) and iRGD-PEG-s-s- chain are introduced to form iRGD-PEG-s-s-PAMAM-His. And the iRGD-PEG-s-s-PAMAM-His/siRNA complexes are prepared by electrostatic absorption. The iRGD is a novel tumor-penetrating interalization RGD peptide with a special cycle structure. This siRNA delivery system has the following characteristics: (1) through PEGylate modification, PAMAM has a high degree of stability so they can stay longer in the body circulation, and thus increase their passive targeting efficiency; (2) introduction of iRGD endows the system tumor homing and cell penetrating bifunction; (3) application of Histidine on PAMAM surface accelerates the "proton sponge effect" and endosomal escape；(4)and then the broken of -s-s- in cytoplasm facilitates siRNA releasing and binding to target gene，resulting in cancer gene silence.

针对现有siRNA非病毒递送系统存在体内递送效率低和/或在靶细胞内转染效率低的问题，本项目旨在构建具循环稳定、肿瘤靶向识别、细胞膜穿透及内涵体逃逸等功能的新型智能siRNA递送系统。该系统以PAMAM为载体，通过化学修饰在其表面引入组氨酸（His）和iRGD-PEG-s-s-链，通过静电作用与siRNA形成iRGD-PEG-s-s-PAMAM-His/siRNA，其中iRGD是一种具有特殊序列结构的环状内化RGD肽，具靶向与透膜双重功能。该siRNA递送系统有以下特点：（1）PEG链修饰，延长PAMAM在体内的滞留时间，提高其被动靶向效率；（2）iRGD的引入，赋予了该复合物靶细胞特异性识别及透膜的双重功能；（3）表面His的修饰，增强其质子海绵效应，促进内涵体快速逃逸；（4）-s-s-桥键的引入，使PEG链可在胞浆高还原环境下自动脱落，有利于siRNA释放与靶基因结合，增强抗肿瘤作用。

本项目在密切结合肿瘤微环境的生理特点，基于功能化载体PAMAM的基础上，设计并构建系列新型的集长循环、主动靶向、还原和pH敏感释药、内涵体逃逸等功能于一体的智能聚合物递送系统，并分别以化疗药与基因药物为模型，通过体内外实验考察载体的性质及抗肿瘤作用机制，为提高抗肿瘤效果提供新策略。.RGD介导还原/pH双重响应与RGD修饰PAMAM靶向载药系统及其抗肿瘤作用机制研究。以4代的聚酰胺-胺阳离子树枝状大分子PAMAM为聚合物骨架材料，通过二硫键将聚乙二醇（PEG）连接在PAMAM的表面，合成不同PEG化程度的PAMAM -SS-PEG（PSSP）聚合物，进一步采用双功能化的HS-PEG5000-COOH偶联cRGDyK肽和PAMAM,合RGD-PEG-SS-PEG- PAMAM （RGD-PSSP）聚合物，并通过TLC、1H NMR和FTIR对其进行了结构确证。以阿霉素（DOX）为抗肿瘤模型药物,制备了RGD-PSSP/DOX复合物。体内外研究表明，RGD-PSSP/DOX具有明显的还原和pH敏感性和良好的抗肿瘤效果，且显著降低DOX对小鼠的毒性。.Tf介导高效肿瘤胞内微环境敏感递药系统Tf-PAMAM-SS-PEG-His（Tf-PSSPH）的构建及其抗肿瘤作用机制研究。该系统具有延长体内滞留时间、肿瘤靶向、快速溶酶体逃逸、pH/还原双敏感释药等功能，实现药物/基因在靶细胞内的高效递送，提高抗肿瘤效果。该递药系统以4代PAMAM为载体，通过组氨酸修饰，合成PAMAM-His；使用交联剂SPDP，将两端功能化的HS-PEG2000-COOH和PAMAM-His连接，合成了PEG-S-S- PAMAM-His (PSSPH)聚合物；通过羧基和氨基的特异性反应将Tf连接在PEG的一端，合成Tf-PSSPH聚合物。该聚合物可分别通过疏水作用和静电吸附作用携载包载抗肿瘤药物DOX和基因药物。体内外实验表明Tf-PSPSH具有显著的还原和pH敏感性，能够快速到达肿瘤部位，并在肿瘤细胞内高效释放药物，有效抑制肿瘤生长，而且能显著降低化疗药物的毒副作用，在癌症治疗中将具有潜在的应用前景。.在此基础上，我们进一步研究了功能化PAMAM联合携载化疗药物与多药耐药逆转剂、化疗药物与siRNA用于抗肿瘤的研究，并取得阶段性成果，为功能化载体PAMAM用于递药系统的研究扩展新思路。