基于长链非编码RNA靶向调节丹参酮类化合物形成的调控机制研究

Tanshinones, the major lipophilic bioactive components of Danshen, are abietane-type diterpenoids. Previous attempts mainly focused on the key enzymes of the biosynthesis pathway, while the regulatory elements received little attention, which is the major bottleneck in comprehensive analysis of the formation and regulation of tanshinones. Long non-coding RNA (lncRNA), a class of RNA molecules longer than 200nt, does not encode proteins, but take part in the epigenetic, transcriptional and post-transcriptional regulation of gene expression. In order to obtain and identify the transcriptional regulators involved in the biosynthesis of tanshinones, in this project, we intends to use transcriptome profiling of the hairy root of Salvia for identification of lncRNA regulating tanshinone synthesis in Salvia. By over-expression and siRNA-mediated gene silencing of lncRNA in the hairy root of Salvia, and quantification of tanshinones,with dCHIRP analysis we will clarify the role of lncRNA in the formation of tanshinones and the regulation mechanism in Salvia. As a science projection, its harvests would reveal the molecular mechanism of tanshinone formation and significantly provide a firm foundation for the protection of important genetic resources of medicinal plants Salvia and its sustainable utilization.

丹参酮类有效成分是中药丹参中一类脂溶性二萜醌类化合物，目前对其代谢途径的关键酶研究颇多，但对其途径的调控基因研究较少，这严重制约了对丹参酮类化合物形成及其调控的全面解析。长链非编码RNA是一类转录本长度超过200 nt的RNA分子，它们并不编码蛋白，而是以RNA形式在表观遗传、转录以及转录后调控等层面上调控基因的表达。为获得丹参长链非编码RNA以及探讨该类基因是如何参与调控丹参酮类化合物的形成，本项目拟通过构建丹参转录组文库，对转录组数据分析获得丹参长链非编码RNA，运用过表达和RNAi技术，构建长链非编码RNA过表达和表达抑制载体，分别转化至丹参毛状根中，结合丹参酮类化合物形成和积累的变化，阐明丹参长链非编码RNA在丹参酮类化合物形成中的作用及其调控机制。本项目的研究对于揭示丹参酮类化合物形成的分子机制具有重要意义，为保护我国药用植物丹参的重要基因资源及其可持续利用研究提供科学依据。

本课题在国家自然科学基金的资助下顺利完成了预期任务。丹参酮类有效成分是中药丹参中一类脂溶性二萜醌类化合物，目前对其代谢途径的关键酶研究颇多，但对其途径的调控基因研究较少，这严重制约了对丹参酮类化合物形成及其调控的全面解析。长链非编码RNA是一类转录本长度超过200 nt的RNA分子，它们并不编码蛋白，而是以RNA形式在表观遗传、转录以及转录后调控等层面上调控基因的表达。为获得丹参长链非编码RNA以及探讨该类基因是如何参与调控丹参酮类化合物的形成，本项目以丹参酮类活性成分作为目标化合物，运用高通量测序技术构建丹参长链非编码RNA文库，通过转录组数据分析获得与丹参酮代谢途径相关非长链非编码RNA，然后通过基因过表达及RNA干扰等分子生物学技术，阐明丹参长链非编码RNA基因在丹参酮类形成中的作用及调控机制。针对丹参酮类化合物生物合成途径上重要的长链非编码RNA探索性研究，取得创新性结果如下：①基于响应面法对丹参毛状根诱导条件的优化。运用Box-Benhnken设计和响应面分析法获得了最佳的诱导培养条件，为丹参毛状根的大规模培养和产业化应用奠定了基础②完成了酵母银离子对丹参酮类化合物诱导。③完成了丹参长链非编码RNA文库的构建。通过酵母银离子诱导丹参毛状根，采用Illumina HiSeq X Ten平台高通量测序分析，构建了丹参毛状根长链非编码RNA文库；④完成长链非编码RNA转录组比较工作。⑤完成丹参酮代谢途径长链非编码RNA与丹参酮代谢途径上关键代谢基因的相关性分析。⑥完成丹参酮代谢途径相关基因的挖掘工作。总之，项目成果将有助于系统阐明丹参活性成分形成的分子机制，填补了丹参酮生物合成途径调控机制的空白，长链非编码RNA作为重要靶基因在中药分子育种及代谢工程、合成生物学等方面的应用，对于丹参分子育种、种质资源评价及有效成分生产具有重要意义。在本项目资助下，发表论文1篇，接收1篇。通过数据整理拟再投稿3篇。项目负责人获得2016年湖南省直优秀青年称号。