肿瘤克隆进化方式所致的瘤内异质性对ALK/EGFR双驱动肺腺癌下游信号通路的影响及分子机制探索

Resistance to targeted therapy is inevitable although targeted therapy is highly precise and effective in advanced lung cancer with oncogenetic driver. The most important reason for resistance to targeted therapy is intratumoral heterogeneity caused by tumor clonal evolution. Therefore, it is very important to explore the evolutionary pattern and the effect of intratumoral heterogeneity on downstream pathway of lung cancer. The lung adenocarcinoma with concomitant oncogenetic alterations of ALK and EGFR is a special sample which could reflect intratumoral heterogeneity directly although it is rare. We will use laser capture microdissection (LCM) and whole exome sequencing to analyze and compare the profile of genetic alterations among different tumor cell populations within the same primary lesion and plot its clonal evolutionary path. And we will use in-situ PCR method to determine whether EGFR mutation and ALK rearrangement could concurrently exist in one adenocarcinoma cell. Then, we will create new lung adenocarcinoma cells harboring both EGFR mutation and ALK rearrangement by lentivirus transfection and compare the activating status and closure status of downstream pathway between new ALK/EGFR coaltered tumor cells and tumor cells with single-driver under different TKIs exposure. The results can help us to determine whether ALK/EGFR coaltered lung cancer is composed of two tumor clones with different single-driver or ALK/EGFR coaltered lung cancer exactly contains a clone with two different oncogenetic drivers concomitantly. It is very important for deeply understanding biologic features of lung adenocarcinoma and treatment decision-making in clinical practice to determine whether the clonal evolution is caused by accumulation of diversity or a behavior for evasion from treatment pressure.

靶向治疗在晚期肺癌中精准性高、疗效显著，但仍不可避免会发生耐药。其中最重要的原因就是肿瘤克隆进化导致的瘤内异质性，故探索肿瘤的克隆进化方式以及瘤内异质性对下游信号通路的影响对肺癌的治疗非常重要。而同时存在两种驱动基因的肺腺癌则是最能直观反映瘤内异质性的特殊研究样本。本研究采用显微微切割及全外显子测序对ALK/EGFR双驱动肺腺癌同一病灶内的多个肿瘤细胞群进行基因突变谱的分析比较，描绘其克隆进化方式。并通过原位PCR技术寻找同时存在两种驱动基因的腺癌细胞。通过慢病毒转染构建ALK/EGFR双驱动的肺癌细胞株，比较在不同靶向药物暴露下其下游信号通路的激活和关闭情况。明确双驱动肺腺癌到底是由两种各自进化出来的单驱动克隆混合构成，还是的确进化出了存在两种驱动基因的肿瘤克隆。以及推测这种克隆进化方式是多样性累积的结果，还是逃避治疗压力的举措？对深入揭示肺腺癌的生物学特性以及制定临床治疗策略意义重大。

近年来，肿瘤内异质性引起了越来越多的关注，大量的癌症统计数据显示，肿瘤内异质性越低，患者存活率越高。然而这种由肿瘤克隆进化方式多样所致的瘤内异质性在ALK/EGFR双驱动肺腺癌中的影响及其相关机制研究却未见报道。课题组前期为了探索 ALK/EGFR 双驱动肺腺癌的肿瘤克隆进化方式，构建1 株 ALK/EGFR 双驱动肺腺癌细胞株，通过观察新建细胞的存活和体外增殖情况，发现新构建的细胞的驱动基因会在细胞传代的过程中发生丢失，提示所构建的EGFR/ALK双驱动肺腺癌细胞的驱动基因状态还不够稳定，故改换临床样本进行突变丰度的测定，并分析突变丰度与相关TKI疗效之间的关系。结果显示EGFR突变丰度与EGFR-TKI的治疗反应显着相关。 并且在接受EGFR-TKI治疗的晚期EGFR突变NSCLC患者中，大量EGFRT790M突变可能会对PFS产生不利影响，而不是对ORR产生不利影响。并且进一步从驱动基因丰度层面证实肿瘤克隆进化方式所致的瘤内异质性，侧面证实了双驱动肿瘤克隆存在的可能性，以及探索这种双驱动肿瘤细胞株的下游信号通路的改变。并通过NGS技术对同一肿瘤原发灶的不同肿瘤细胞种群及不同的转移灶进行深度测序，搭建专门用于肿瘤克隆分析的生信流程对真实状态下的临床肺癌样本进行克隆进化的分析，绘制出克隆组成图谱以及克隆进化的纵向时间轴。分析了TCGA数据库中147例肺腺癌患者的NGS数据，发现了18175个克隆性体细胞突变，平均每例患者表达124个突变。这些突变会形成突变肽段，可通过HLA Class II分子进行预测。肺癌中常见的一些基因突变所产生的新抗原都可能能够被HLA Class II分子预测。此外，我们还回顾性分析接受手术切除的178例NSCLC患者的免疫相关标记物，结果指出不能采用单纯的PD-L1水平，去评估NSCLC患者的预后价值，建议用PD-L1表达和CD8+ TILs密度的结合。并且在这些患者中，有不到一半的患者原发灶和转移灶的PD-L1表达不一致。因此在晚期NSCLC中的对于包括PD-L1在内的相关基因表达水平的评估应该要更加全面。进而有效降低瘤内或瘤间异质性对分子检测或诊断过程中产生的不利影响。