免疫原性氨基酸调控单B细胞体外分化的信号途径研究及其在HER2全人源抗体制备中的应用

Single B cell technology is a high-efficient strategy for acquiring human antibody genes developed in recent years. The application of this technology, however, meets restrictions when the target antigen is autologous protein, in which the acquisition of antigen-specific B cell is very difficult because of self tolerance. In our previous work, we build a strategy for broking self tolerance by incorporating immunogenic amino acid into autologus proteins, which provides an efficient reliable source of antigen-specific B cell. However, the mechanism of immunogenic amino acid breaking immune tolerance remains unknown. As a result, designing the self antigen with immunogenic amino acid is lack of effective theory guidance. Moreover, inducing B cells differentiate in vitro using self antigen containing immunogenic amino acid need the understanding of the mechanism of immunogenic amino acid breaking self tolerance. The project intends to further research into the signal pathways of immunogenic amino acid breaking immune tolerance and provide the basis of theory and methodology for developing human antibody durgs targeting autologous proteins.

单B细胞抗体技术是近年来发展起来的一种高效获取全人源抗体基因的方法。但在非感染性疾病的治疗性抗体开发中，目标靶点多为自体蛋白，由于自身免疫耐受，获取抗原特异性B细胞十分困难，限制了单B细胞技术在此领域中的应用。我们在前期研究工作中，建立了将免疫原性氨基酸引入自体蛋白中突破自身免疫耐受的方法，为解决抗原特异性B细胞来源问题提供了有效的方法。由于免疫原性氨基酸突破自身免疫耐受的机理尚不清楚，如何利用免疫原性氨基酸设计自体抗原并体外诱导B细胞分化形成抗原特异性B细胞还缺乏有效的理论指导。本项目拟对免疫原性氨基酸突破自身免疫耐受的信号途径进行深入研究,以此为基础建立基于免疫原性氨基酸诱导的B细胞体外分化和单B细胞分选体系，以肿瘤相关抗原HER2为靶点，筛选获得抗HER2全人源抗体，将单B细胞抗体技术应用于针对自身蛋白的全人源抗体药物开发，为非感染性疾病的治疗性抗体药物开发提供理论指导和方法学基础。

单B细胞抗体技术是近年来发展起来的一种通过分选人外周血中单个抗原特异性B细胞，获取天然抗体基因用于抗体药物开发的方法。尽管单B细胞抗体技术具有快速、高效、高通量等优势，但由于自身免疫耐受的限制，获取针对自身抗原的特异性B细胞十分困难，使其应用受到极大限制。. 为了解决这一问题，本项目在通用CD4+T细胞表位的不同位点引入对硝基苯丙氨酸，证实了免疫原性氨基酸通过激活CD4+T细胞打破免疫耐受，诱导其向Tfh细胞分化；筛选获得了能够被不同MHC II类分子识别的通用硝基化T细胞表位，利用这种通用硝基化T细胞表位制备了HER2自身抗原分子；建立了“滤泡辅助性T细胞-B细胞”共培养体系，证实含通用硝基化T表位的HER2抗原能诱导naïve B细胞分化为HER2特异性IgM+B细胞；利用重度免疫缺陷小鼠进行人免疫系统重建，将体外激活的抗原特异性淋巴细胞移植到NCG小鼠体内，使抗原特异性B细胞在小鼠体内成熟为抗原特异性IgG+B细胞，最后通过单B细胞分选和BCR测序，获得了高亲和力的全人源抗HER2抗体，并对抗体进行鉴定及初步性质研究。. 本项目获得的重要研究成果有两个方面：1）建立了利用免疫原性氨基酸制备自身抗原分子的通用方法：本项目筛选获得的通用硝基化T细胞表位可以突破MHC II类分子的限制，激活不同来源的PBMC细胞，为获得针对人自身蛋白的抗原特异性B细胞提供了有效的解决方案；2）建立了获取抗原特异性IgG+B细胞的通用方法：利用“滤泡辅助性T细胞-B细胞”共培养体系进行抗原体外刺激，再将激活的抗原特异性淋巴细胞移植到重度免疫缺陷小鼠体内，给IgM+B细胞提供体内分化成熟的环境，随后用单B细胞分选技术分选抗原特异性IgG+B细胞，这种“体外激活-体内成熟”的方法，为获取抗原特异性的IgG+B细胞提供了通用方法，也为后续靶向其他自体蛋白的抗体药物开发提供了理论基础。