拟态弧菌OmpU黏附素与受体作用的分子基础及黏附拮抗肽筛选

Vibrio mimicus (V. mimicus) is an important zoonotic pathogen . Bacterial adhesion mediated by adhesins is the key link that V. mimicus cause ascitic fluid disease in aquatic animals. Related research suggests that the outer membrane protein U (OmpU) is the adhesin of V. mimicus, but the molecular basis underlying the interaction between the OmpU adhesin and receptor protein on the host cell surface is not yet clear. The structural features of V.mimicus OmpU protein were analyzed, and then seven immunodominant linear B-cell epitopes of OmpU protein were identified in our previous studies. On the basis of further confirm the adhesion role of the OmpU, in this study，we intends to display the OmpU peptides which containing the epitopes using the type V secretion system and to ascertain the receptor binding domain of OmpU by the adhesion test firstly. Then, we plan to screen and identify the OmpU receptor protein on the host cell surface by the yeast two-hybrid membrane protein system binding co-immunoprecipitation method. In the end, the binding peptide of OmpU receptor binding domain and the binding peptide of OmpU receptor protein will be screened using phage random peptide library, and their adhesion antagonistic effect will be evaluated with cell model and animal infection model. In sununary，research results not only would lay the foundation for elucidating the molecular adhesion mechanisms of V. mimicus and for developing adhesion antagonists or adhesion blocking agent against V. mimicus, also would provide a new strategies for the prevention and treatment of ascitic fluid disease in aquatic animals.

拟态弧菌是一种重要的人和水产动物共患病原菌，该菌通过黏附素定植于宿主细胞表面是引发水产动物腹水病的关键环节。相关研究显示外膜蛋白OmpU是拟态弧菌的黏附素，但OmpU黏附素与宿主受体相互作用的分子基础尚未明确。课题组已克隆分析了拟态弧菌安徽分离株OmpU蛋白的序列和结构特征，鉴定获得了OmpU蛋白的7个B细胞抗原表位序列。本项目在进一步确认OmpU蛋白的黏附作用基础上，拟利用细菌V型分泌系统展示包含表位序列的OmpU肽段并经黏附试验探明OmpU黏附素的受体结合域。然后选用酵母双杂交膜蛋白系统结合免疫共沉淀方法确定OmpU宿主细胞受体蛋白。最后应用噬菌体随机肽库筛选分别能与OmpU黏附素结合域和受体蛋白相结合的高亲和力结合肽，并通过细胞模型和动物感染模型评价其黏附拮抗效应。项目的实施将为阐明拟态弧菌的分子黏附机制和研制黏附拮抗或阻断剂奠定基础，也为水产动物腹水病的防治提供新思路和新策略。

拟态弧菌是危害水产养殖业发展的重要病原菌，该菌通过黏附素黏附定植于易感宿主细胞表面是引发水产动物腹水病的关键环节。相关研究显示OmpU蛋白是拟态弧菌的重要黏附素，但OmpU蛋白与宿主受体相互作用的分子基础尚未明确。本项目主要开展拟态弧菌在感染草鱼内的动态分布、OmpU蛋白抗原表位鉴定、OmpU蛋白黏附功能的确认及其黏附功能域的确定、草鱼肠黏膜组织中OmpU互作蛋白的挖掘、高亲和力黏附拮抗肽的筛选等研究。取得的主要研究结果如下：.（1）在构建重组表达质粒pBAD24-EGFP基础上，将该重组质粒转化至拟态弧菌鱼源分离株，获得荧光标记的拟态弧菌。通过荧光蛋白跟踪该菌在感染草鱼体内的动态分布，确定肠道是拟态弧菌黏附定植与繁殖的主要靶器官。.（2）在构建拟态弧菌04-14分离株OmpU基因缺失株的基础上，通过黏附试验以及间接免疫荧光技术检测缺失株与OmpU蛋白对EPC细胞是否具有的黏附作用，从而确认OmpU蛋白是拟态弧菌的重要黏附素。.（3）首先联合采用表位预测法、肽ELISA和噬菌体展示技术鉴定获得6条OmpU蛋白免疫优势B细胞表位肽。然后荧光示踪技术和流式细胞技术检测OmpU蛋白表位肽对EPC细胞的特异结合性, 探明OmpU蛋白N端90~101和173~192氨基酸区域为其黏附功能域。.（4）以His-OmpU融合蛋白为诱饵蛋白，利用His-tag pull down试验筛选草鱼肠组织蛋白中可与OmpU蛋白互作的受体蛋白，并进行液相色谱-串联质谱鉴定。发现α-肌动蛋白1、α-肌动蛋白2、细丝蛋白A、α-辅肌动蛋白4和转胶蛋白2均与OmpU蛋白存在互作关系。.（5）以OmpU纯化蛋白为靶标分子，对噬菌体随机12 肽库进行亲和淘选，获得3条OmpU结合肽。在此基础上，通过细胞模型和动物感染模型评价其黏附拮抗活性以及采用非竞争ELISA法测定其亲和常数，证实3条OmpU结合肽中P1和P2为高亲和力的黏附拮抗肽。. 综上所述，本项目的完成为阐明拟态弧菌分子黏附机制和研制黏附拮抗奠定了良好基础，也为水产动物腹水病的防治提供了新策略。