新发猪肠道甲型冠状病毒的细胞入侵及跨种传播的分子机制研究

We discovered a novel swine enteric alphacoronavirus (tentatively named SeACoV) evolutionally related to the bat coronavirus HKU2 in southern China in 2017. SeACoV is the fifth porcine coronavirus, causing severe diarrhea in newborn piglets similar to porcine epidemic diarrhea virus (PEDV); however they are not related to each other. The biology and functional study of this novel virus has not been started yet. Previously, we have demonstrated virus isolation, serology, virus morphology, complete genome cloning, phylogenetic analysis and pathogencity of SeACoV (Pan et al., Discovery of a novel swine enteric alphacoronavirus (SeACoV) in southern China. Veterinary Microbiology, 2017, 211:15-21). We will focus on the molecular mechanism of virus entry into host cells. By using approaches of proteomics, viral reverse genetics, structure biology, biochemistry and cell biology, we plan to identify the unknown cellular receptor and co-receptor first, and will subsequently investigate the membrane fusion between virus and cell, proteolytic activation of the spike (S) protein and virus entry pathways. The results will provide an outline of SeACoV entry into the cell, further revealing how SeACoV came from HKU2 through cross-species transmission. This study will pave the way for demonstrating the mechanisms of SeACoV pathogenesis from the view of virus entry, understanding the origin of swine enteric coronavirus from wild animals in nature, and facilitating future vaccine and drug development of SeACoV, which have important implications for both basic virology and practical intervention strategies in the field.

2017年在华南首次发现的猪肠道甲型冠状病毒（swine enteric alphacoronavirus， SeACoV）引发仔猪严重腹泻，是进化起源为蝙蝠HKU2-CoV的新型冠状病毒。目前对该病毒的研究报道极少。申请人在已进行了病原分离、血清学、全基因组克隆、进化分析及回归感染试验的基础上，在本研究中聚焦于SeACoV的细胞入侵机制。计划综合运用蛋白组学、病毒反向遗传学、结构生物学和细胞生物学等交叉研究手段，从分离SeACoV受体入手，系统性地研究病毒入侵的膜融合、纤突（S）蛋白剪切激活及病毒入侵途径，期望为SeACoV入侵宿主细胞提供全景式的概貌，并揭示SeACoV如何从HKU2跨种传播的分子基础。本研究的实施和完成将为从病毒入侵细胞层面理解SeACoV的致病机理、猪肠道冠状病毒在自然界的野生动物起源及研发抗SeACoV的药物与疫苗提供理论依据，具备重要的科学意义和应用前景。

本项目（1）系统性的开展了对SeACoV（后来统一命名为SADS-CoV）的病原学研究，制备了针对SADS-CoV病毒蛋白的多克隆抗体，结合感染细胞过程中病毒蛋白的细胞定位以及病毒亚基因组mRNA组成，鉴定病毒入侵细胞后的感染复制过程。使用不同物种或组织来源的细胞系进行了细胞系感染的敏感性研究，证明了SADS-CoV在体外具有广泛的物种嗜性，为探索SADS-CoV细胞入侵的分子机制提供实验基础。.（2） 建立了稳定且便于操作的SADS-CoV反向遗传学研究系统，成功拯救出稳定传代的子代病毒rSeACoV，并以此为基础构建并拯救出绿色荧光标记的重组病毒rSeACoV-GFP，为精准研究冠状病毒的功能与开发弱毒疫苗提供强大的工具。.（3）以小鼠和雏鸡为研究对象，建立SADS-CoV攻的感染模型，并发现SADS-CoV能够感染小鼠脾脏树突状细胞，提示SADS-CoV具有跨物种传播的潜力；基于这些感染模型应用于将来的抗病毒药物与疫苗的研究。.（4）验证了SADS-CoV不能够利用已知的冠状病毒受体入侵细胞，并使用S1、S1A及S1B蛋白进行细胞表面结合及阻断感染实验，阐明了S1B结构域是受体结合的区域，即RBD。通过血凝实验证明了S1A结构域与唾液酸相互作用辅助病毒入侵感染细胞。建立的猪肠道类器官感染模型，并鉴定了SADS-CoV通过小窝蛋白介导的内吞途径入侵细胞。这些揭示了SADS-CoV入侵宿主细胞的关键机制。.（5）通过比较不同属的冠状病毒N蛋白，探究SADS-CoV N蛋白介导RIG-I的泛素化并导致RIG-I进入蛋白酶体依赖的降解，从而抑制宿主I型干扰素产生的机制，为探究病毒感染复制与宿主天然免疫反应调控的研究提供参考。