基于lncRNA与甲基化的优质超细毛羊毛囊发育表观遗传学研究

The most important function of lncRNAs is the epigenetic mechanism involved in the regulation of gene expression regulation, which is almost involved in the regulation of related genes in each stage of life development cycle. Based on RNA-seq sequencing of skin tissue during different hair follicle development of ultra-fine wool sheep. As a result, the differentially expressed lnc27409 was associated with hair fllicle development-related genes KRT14, KRT25, Hoxc13, Wnt5B and BMP3. In this study, Mass ARRAY and heavy sulfite sequencing were used to analyze the degree of methylation of hair follicle development-related genes in the skin growth and short-term skin of Soba Merino sheep. The qRT-PCR technique was used to determine the degree of hair follicle Development of the gene and DNA methyltransferase gene in the relative expression of CRISPR/Cas9 gene editing technology, the establishment of lnc27409 knockout system, the system in depth from the epigenetic level of candidate genes on hair follicle development regulation mechanism. Through the implementation of the project, the molecular genetic mechanism of wool growth was established, and the methylation database related to hair follicle development was established to provide new DNA methylation markers for enrichment of fine maize molecular MAS breeding, and to improve the variety and use of modern biotechnology Performance lay the theoretical foundation.

lncRNAs最重要的功能是参与编码基因表达调控的表观遗传机制，基于前期对超细毛羊不同毛囊发育时期皮肤组织的RNA-seq测序结果，差异表达的lnc27409与毛囊发育相关基因KRT14、KRT25、Hoxc13、Wnt5B和BMP3等基因有关。本研究拟利用Mass ARRAY和重亚硫酸盐测序法对苏博美利奴羊在毛囊发育不同时期皮肤组织中相关基因的甲基化程度进行分析，并利用qRT-PCR技术测定与毛囊发育相关基因和DNAMTs基因的相对表达量，同时利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，建立lnc27409的敲除系统，系统深入地从表观遗传学水平上解析候选基因对毛囊发育的调控机制。通过项目的实施，揭示调控羊毛生长的分子遗传机制，建立与毛囊发育相关的甲基化和lncRNA数据库，为丰富细毛羊分子 MAS 育种提供新表观遗传标记，为利用现代生物技术改良品种和提高生产性能奠定理论基础。

苏博美利奴羊是我国的超细毛羊新品种，其羊毛生长和毛囊发育过程一直受到研究者的关注。DNA甲基化作为重要的表观遗传机制在基因表达、基因组印记等多个生物学过程发挥作用。DNA甲基化可以通过调节毛囊发育相关基因的表达进而发挥作用。首先，本研究选取苏博美利奴羊胚胎期和出生后不同毛囊发育时期的皮肤组织为研究对象，运用DNA甲基化免疫沉淀和高通量测序技术，筛选了一系列差异甲基化基因，参与各种与毛囊发育相关的通路代谢途径。其次，研究分析了ITGB2、IGFBP4、IGFBP2、WNT2基因在苏博美利奴羊不同细度皮肤组织中的DNA甲基化水平与表达量，并筛选出6个关键的转录因子JUN、EP300、SP1、PAX6、ETS1、MYOD1，为探究与毛囊发育相关的表观遗传标记和转录因子提供理论依据。再次，构建了慢病毒pLEX-MCS-WNT2表达载体，初步验证了WNT2基因功能；将慢病毒pLEX-MCS-WNT2表达载体共转染至绵羊皮肤成纤维细胞中，最后使用CCK-8试剂盒鉴定了绵羊皮肤成纤维细胞的增殖情况，进一步确定WNT2基因对毛囊发生发育的影响。. 通过对本课题的实施完成比较苏博美利奴羊毛囊发育6个时期相邻比较组的DNA甲基化区域，共注释到596个差异甲基化基因（DMGs）；运用DNA甲基化免疫沉淀和高通量测序技术，筛选了一系列差异甲基化基因，参与各种与毛囊发育相关的通路代谢途径；分析了ITGB2、IGFBP4、IGFBP2、WNT2基因在苏博美利奴羊不同细度皮肤组织中的DNA甲基化水平与表达量，并筛选出6个关键的转录因子，为探究与毛囊发育相关的表观遗传标记和转录因子提供理论依据；经双酶切与测序鉴定，成功构建了慢病毒pLEX-MCS-WNT2表达载体；培养研究生5名；在 SCI 国际源期刊杂志发表论文3篇，核心期刊发表论文7篇；获得实用新型专利申请2项，地方标准颁布3项。