促进水牛iPSC向初始态转化的分子机制探讨以及候选初始态分子标记筛选

Buffalo is the important livestock in south China with the characteristics of crude feed tolerance and strong disease resistance. At the same time the buffalo milk has higher nutritional value than ordinary milk. The application of pluripotent stem cells combined with micromanipulation and transgenic techniques is expected to accelerate the genetic improvement of buffalo, so as to promote the development of buffalo industry. In order to obtain the applicable buffalo pluripotent stem cells, in this study we will conduct small molecules high-throughput screening, then hopefully screen out some small molecules which can promote the transformation of naïve pluripotency, consequently, generate some buffalo iPSC cell lines with different pluripotent stages determined by chimera formation techniques. Transcriptomics technology is applied to compare the difference in molecular level among those buffalo iPSC with different pluripotent potential, and preliminarily determine the key controlling genes and their regulation network during the process of low to high pluripotency potential (even to Naïve stage), moreover, attend to analyze and screen out the candidate molecular markers for Naïve pluripotency, so as to enrich theory of livestock iPSC reprogramming and the maintenance of pluripotency.

水牛是中国南方重要的家畜，具有耐粗饲，抗病力强的特点。同时水牛奶具有比普通牛奶更高的营养价值。应用多能干细胞结合显微操作及转基因技术有望加速水牛遗传改良，从而促进水牛产业的发展。为了获得可以应用的水牛多能干细胞，本研究将对小分子化合物进行高通量筛选，有望筛选出促进水牛iPSC向初始态(Naïve)转化的小分子化合物，从而获得具有不同多能性状态的水牛iPSC细胞系。利用嵌合体技术对所获得的水牛iPSC进行多能性潜力的评价和分类(低潜力多能性，高潜力多能性，候选Naïve 多能性iPSC)。运用转录组学技术分析对比具有不同多能性潜力的水牛iPSC在分子水平的差异，初步探明水牛iPSC从低潜力多能性向高潜力多能性（甚至Naïve状态）转化过程中的关键调控基因以及相关调控网络，同时尝试分析筛选出可能属于初始态Naive多能性的候选分子标记，从而充实大家畜iPSC重编程和多能性维持的理论。

水牛是中国南方重要的家畜，具有耐粗饲，抗病力强的特点。同时水牛奶具有比普通牛奶更高的营养价值。应用多能干细胞结合显微操作及转基因技术有望加速水牛遗传改良，从而促进水牛产业的发展。本研究建立了分别利用pDC316-mCMV-EGFP载体的腺病毒和PiggyBac转座子系统介导的水牛体细胞重编程技术方案。同时初步筛选出SB431542，A-83-01，Dorsomrphin，SB203580以及SP600125等对水牛iPSC的重编程有显著的促进作用。另外也筛选出了促进水牛iPSC传代培养的小分子化合物，包括甲基化转移酶抑制剂RG108，抗凋亡抑制剂Y-27632以及Thiazovivin，自噬（autophagy）抑制剂雷帕霉素等。通过转录组分析发现，目前所获得的水牛iPSC的LTF, BMP, WNT信号已被初步激活，其WNT4、WNT5A显著性上调，但在FZD受体通路中仅有FZD1出现了显著性上调，因此进一步激活FZD1相关基因可能是促进水牛iPSC最终获得完全多能性（naive pluripotency）的关键。本研究为下一步获得具有完全多能性的水牛以及其他大家畜多能干细胞奠定技术和理论基础。这些研究成果为进一步利用干细胞以及核移植技术进行水牛遗传改良提供了可行性。