长非编码RNA lncENC1在胚胎干细胞初始态维持中的作用及机制研究

There are at least two states of pluripotency: naive and primed, which show distinct developmental potentiality, cellular morphology and molecular characteristics, but the molecular mechanisms remain poorly understood. Long noncoding RNAs (lncRNAs) play essential roles in diverse biological processes including development，differentiation，and reprogramming. However, to date, their roles in naïve ESCs have not been reported. Based on the established in vitro ESC-EpiLC transformation model, we have analyzed stranded transcripts by ultra-deep RNA-seq and identified 79 annotated lncRNAs, which are differentially expressed in naïve ESCs compared to EpiLC. Importantly, our data demonstrated that lncENC1 could be a key regulator for maintaining mESC of naive state. To further reveal the roles of lncENC1, we plan to identify its target genes and partners in ESCs, and investigate its functions in embryonic development based on a knockout mouse model. This project will contribute to revealing the molecular mechanism underling naïve pluripotency, and to improving ESC technologies in mouse and other animals.

多能干细胞至少包括初始态（Naive state）和激发态（Primed state）两种状态，二者在发育潜能、细胞形态、分子指标等方面均有明显区别，而初始态维持的分子机制目前仍不完全清楚。长非编码RNA（lncRNA）可参与调控胚胎发育、细胞分化与重编程等重要生物学过程，但其在胚胎干细胞（ESC）初始态维持中的作用仍未见报道。本项目的前期研究基于ESC初始态向激发态转化的细胞模型，鉴定出79条初始态ESC 特异表达的lncRNA，并筛查了部分lncRNA的功能，发现lncENC1为ESC初始态维持所必需。本项目拟在此基础上继续深入研究lncENC1在ESC初始态维持中的作用及机理：鉴定其调控靶点及互作蛋白；阐明其与多能因子调控网络之间相互关系；探析其对小鼠体内胚胎发育的影响。通过这些研究，有望较早揭示调控干细胞初始态的lncRNA分子，为初始态维持的分子机制探讨及方法学改进提供新的依据。

体外培养的初始态胚胎干细胞具有不同于其他状态的多能性细胞的特性，可以较好反映出体内多能细胞的真实状态，然而对初始态胚胎干细胞的多能性维持以及自我更新分子机制的理解仍不完全。为此，我们检测并比较了小鼠初始态与激发态胚胎干细胞的转录组，鉴定出135条在初始态胚胎干细胞中特异性表达的长链非编码RNA(lncRNA)。通过初步的功能筛查，确定其中一条表达量非常高的lncRNA Lncenc1进行深入研究。我们通过Northern blot实验证实了Lncenc1大小约为3400bp，并且通过核质分离实验确定Lncenc1转录本在细胞核与细胞质中均有分布。通过shRNA或ASO的表达敲低以及CRISRP-Cas9介导的基因敲除实验都显示Lncenc1的表达下调会导致胚胎干细胞核心多能转录因子表达水平及克隆形成能力的显著下降。多方面的实验证据表明Lncenc1的高表达有助于初始态胚胎干细胞的自我更新。进而，我们通过RNA-seq实验发现敲低Lncenc1的胚胎干细胞中糖酵解通路相关基因也发生了显著的表达下调，并且通过代谢物检测发现葡萄糖消耗及乳酸生成均显著降低，说明胚胎干细胞糖酵解能力的整体下调。进一步研究发现胚胎干细胞的核心多能性调控网络不仅可以直接调控糖酵解基因的表达，还可以通过调控Lncenc1表达来影响糖酵解基因的表达，而糖酵解能力的下调反过来又能对多能性网络进行调控。我们通过RNA pull-down实验发现 Lncenc1与RNA结合蛋白PTBP1和HNRNPK相互作用，用 shRNA将Ptbp1和Hnrnpk分别敲低之后，也导致了多能性转录因子以及糖酵解相关基因的表达下调。ChIP实验进一步证实HNRNPK蛋白结合在糖酵解相关基因的启动子区域，调控糖酵解基因的转录。因此，本论文的研究发现Lncenc1、PTBP1以及HNRNPK形成功能复合物，通过直接调控糖酵解基因的转录来维持胚胎干细胞的多能性以及自我更新。. 本项目的研究成果有助于加强我们对初始态多能性分子机制的理解，并突显出lncRNA对能量代谢通路及干细胞命运的重要桥梁作用。