靶向表皮生长因子受体蛋白的泛素化降解在头颈鳞癌细胞中的实验研究

The epidermal growth factor receptor(EGFR) has been shown to be overexpressed in in head and neck squamous cell carcinoma,its down-regulation depend on effect of Cbl- a ubiquitin ligases E3.Using certain chimeric E3s or proteolysis targeting chimeric molecules(Protacs) can provide an entirely new approach to specifically target cancer-causing proteins for ubiquitination and degradation.InThis strategy,we designed and synthesized a Protac,which binds to E3 ubiquitin ligases complex and linked to protein of EGFR.After treating the EGFR-positive head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) cell lines with the Protac ,we will observe the changes in EGFR levels by western blot and immunopricipitation;the cell growth by XTT and other malignant behaviors by Flow Cytometry,Matrigel Invasion Assays,Tumorigenicity Assays in vivo,respectively.Therefore,reconstructing or enhancing ubiquitin ligase E3 activity and its negative regulation to targeting EGFR for ubiquitination and degradation might promise a new approach and strategy to treat HNSCC．

表皮生长因子受体（EGFR）在头颈鳞癌中广泛过表达，其负向调节取决于Cbl等泛素连接酶E3介导的泛素化降解。融合蛋白E3或嵌合分子（Protac）特异性靶向目的蛋白而泛素化降解是一新策略。我们设计、合成一种与EGFR和E3连接酶均能结合的小分子化合物Protac，体外泛素化实验鉴定其泛素连接酶活性并处理不同人头颈鳞癌细胞株，分别采用免疫印迹、免疫沉淀观察对癌细胞靶蛋白EGFR表达的影响，流式细胞仪检测癌细胞周期、细胞凋亡变化，XTT检测、基质胶侵袭试验及裸鼠成瘤实验分别比较各组不同癌细胞体外生长、侵袭转移和成瘤能力。重建或加强靶向EGFR蛋白泛素化降解的泛素连接酶E3的活性可望为头颈部鳞癌的治疗提供一种新思路与策略。

表皮生长因子受体（EGFR）在头颈鳞癌中广泛过表达，其负向调节取决于Cbl等泛素连接酶E3介导的泛素化降解。嵌合分子（PROTAC）特异性靶向目的蛋白而泛素化降解是一新策略。我们设计和合成了一种与EGFR和E3连接酶复合体均能结合的嵌合分子E-PROTAC，以其处理鼻咽癌CNE2细胞株和其他头颈鳞癌细胞株。分别采用免疫印迹观察E-PROTAC对癌细胞靶蛋白EGFR表达及其下游信号分子AKT和ERK的影响，XTT检测对癌细胞生长增殖的影响、流式细胞仪检测对细胞周期、细胞凋亡变化，基质胶侵袭试验及裸鼠成瘤实验检测对癌细胞体外生长、侵袭转移和成瘤能力抑制的影响。. 按照项目研究计划完成情况如下：根据文献资料完成了嵌合分子（E-PROTAC）的设计和合成；并将该嵌合分子应用于鼻咽鳞癌细胞株CNE2进行功能实验，免疫印迹（Western Blots）试验证实嵌合分子通过泛素-蛋白酶体系统泛素化降解EGFR蛋白的水平，随浓度增加降解越多，下游信号分子(AKT和ERK）磷酸化没有变化或稍增高；癌细胞体外抑制试验(XTT)表明：与对照组比较该嵌合分子能明显体外抑制癌细胞的生长；E-PROTAC处理CNE2细胞后流式细胞仪检测癌细胞早期凋亡率明显增多。现有实验结果已初步阐明E-PROTAC嵌合分子合成是成功的，功能实验也表明E-PROTAC能导致EGFR蛋白的泛素化降解和抑制CNE2鼻咽癌细胞的生长及增加癌细胞凋亡。. 尚未完成的工作有E-PROTAC对CNE2癌细胞基质胶侵袭试验和将该嵌合分子应用于荷瘤裸鼠体内试验以及在其他2个头颈部细胞株的实验。项目滞后的主要原因是合成该嵌合分子过程不顺利，难度大，合成周期较长，耗时8-9个月，而本项目规定期限仅为一年，接下来我们将全力尽早完成后续工作。. 通过今后进一步研究和改进，嵌合分子（E-PROTAC）将重建或加强靶向EGFR蛋白泛素化降解的泛素连接酶E3的活性，可望为头颈部鳞癌的治疗提供一种新思路与策略。