蛇足石杉聚酮合酶在石杉碱甲生物合成中的功能及其在组合合成中的应用

Huperzine A isolated from H. serrata is a potent, selective, and reversible inhibitor of acetylcholine esterase (AChE)，and is commonly used to treat neurodegenerative disease including Alzheimer’s disease. Genes related to the biosynthesis of huperzine A are currently kept deep unknown. Our previous investigations suggested that polyketide synthases (PKSs) are most probably involved in the biosynthesis of huperzine A. Therefore, PKS genes in H. serrata will be screened by transcriptome sequencing and homology-based cloning strategies. Using RT-PCR, Western-blot and LC-MS/MS technologies, the functions of H. serrata PKSs in the biosynthesis of huperzine A will be investigated by in vitro catalytic potential analysis of the recombined PKSs proteins, and by comprehensive analysis of the correlations of PKS genes′ in vivo expression levels and the quantity of huperzine A in H. serrata. Hopefully, genes involved in the biosynthesis of huperzine A could be screened out, which would be meaningful for the scalable preparation of huperzine A using bioengineering technologies. On the other hand, using the recombined PKS proteins from H. serrata, a library containing structurally diverse unnatural natural products will be constructed using combinatorial synthesis strategies based on substrate directed and protein structural modification, which would be meaningful for the screening and discovery of lead compounds with potential activities.

石杉碱甲是从蛇足石杉中分离得到的具有高效、可逆、高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂，临床上广泛用于治疗老年痴呆症。目前石杉碱甲的生物合成途径及相关基因尚不清楚。课题组前期研究结果提示蛇足石杉中聚酮合酶可能参与了石杉碱甲的生物合成。本项目拟利用转录组测序及同源克隆技术，对蛇足石杉中聚酮合酶基因进行筛选、克隆表达，并对重组酶的活性进行分析；利用实时荧光定量PCR、Western-blot、LC-MS/MS等技术，对聚酮合酶基因在体内的表达水平与石杉碱甲合成之间的相关性进行研究，阐明蛇足石杉中聚酮合酶在石杉碱甲生物合成中的功能，以期能够发现与石杉碱甲生物合成相关的关键基因，为利用生物工程技术实现石杉碱甲的规模化、绿色合成奠定基础。另一方面，利用获得的聚酮合酶，开展以底物和蛋白质结构修饰为导向的组合合成，构建结构新颖多样的“非天然天然产物”库，供活性先导化合物的筛选与发现。

石杉碱甲是从蛇足石杉中分离得到的具有高效、可逆、高选择性的乙酰胆碱酯酶抑制剂，临床上广泛用于治疗老年痴呆症。目前石杉碱甲的生物合成途径及相关基因尚不清楚。本项目首先对蛇足石杉中生物碱类成分进行了分离鉴定，共获得包括石杉碱甲在内共15个生物碱，其中新化合物5个，发现2个新化合物对乙酰胆碱酯酶具有抑制活性；以分离获得的生物碱为对照品，利用LC-MS对不同产地、不同组织部位的9个蛇足石杉样品及同属植物柳杉叶马尾杉中的生物碱类成分进行了定性、定量分析，获得各样品中“生物碱分布及含量谱”；利用转录组测序技术完成上述10个样品的转录组测序分析，结合各样品中“生物碱的分布及含量谱”，成功从蛇足石杉中挖掘、克隆表达5个聚酮合酶、从柳杉叶马尾杉中挖掘、克隆表达3个聚酮合酶；首次发现2个聚酮合酶能够催化合成3-oxo-4-(piperidin-2-yl)butanoic acid（石杉碱甲生物合成的关键前体），率先阐明了聚酮合酶在石杉碱甲生物合成中的功能，为彻底阐明石杉碱甲生物合成机制提供了突破；另一方面，利用获得的聚酮合酶，开展了酶催化组合合成，成功构建了含有系列2-取代喹诺酮生物碱、1,3-二酮、喹嗪酮生物碱等结构母核在内的非天然小分子库，结合体外活性筛选，发现4个具有显著抗炎作用的活性分子，为合成活性天然产物提供新方法；建立了多酶联合催化合成黄酮、喹嗪酮生物碱方法，为实现该类成分在微生物中的合成制备提供了必要的基因元件；此外，项目研究中还对蛇足石杉内生菌合成石杉碱甲的可能性进行了探讨，从蛇足石杉中分离鉴定40余株内生真菌并对其代谢产物进行了分析、分离鉴定及活性筛选，虽没有发现能够产生石杉碱甲的内生真菌，但分离鉴定了系列结构新颖的天然产物，部分化合物具有潜在抗炎活性。