基于比较基因组学的蛇足石杉内生真菌合成石杉碱甲机制研究

Huperzine A (Hup A), discovered by Chinese scientists, is one of lycopodium alkaloid to treat mild-to-moderate Alzheimer's disease. However, it is difficult to chemically synthesize Hup A, to artificially cultivate and tissue culture Huperziaceae plants. The limited resource of Hup A, which is mainly isolated from decreasing Huperzia serrata and some other species in Traditional Chinese medicine resources (such as Huperziaceae) in low quantity, restricts its pharmaceutical production. In this project, we isolated two HupA-producing fungi Colletotrichum gloeosporioides Cg-01 and Penicillium polonicum Pp-hy4 from H. serrata previously. Based on genomic and transcriptomic sequencing of these two endophytic fungi, we will further do comparative genomics and transriptomics, combining with function-verification by in vivo (e.g. gene-knockout and retro-complementation and overexpression, etc.) and in vitro (e.g. yeast one-hybrid system, ChIP-Seq and dual luciferase report system, etc.) assays, to analyze the biosynthetic pathway and to dig out transcriptional regulation factors and epigenetic regulation factors. This study will provide insights into the mechanism of Hup A biosynthesis and regulation, be of great importance to biosynthesize HupA, consequently resolving the problem of limited natural resources and realizing sustainable development.

石杉碱甲是我国自主研发治疗轻中度阿尔茨海默症的石松生物碱类药物，由于其化学合成技术体系不成熟，加之石杉类植物的人工栽培与组织培养困难，目前仅能从日益匮乏的野生蛇足石杉等中药资源中微量提取，严重制约了其药物生产。本项目以两株具有合成石杉碱甲能力的蛇足石杉内生真菌胶胞炭疽Cg-01与波兰青霉Pp-Hy4为研究对象，在已完成的全基因组测序与转录组测序的基础上，通过比较基因组学与转录组学研究，结合基因敲除与回补、过表达等体内实验以及酵母单杂交技术、ChIP-Seq与双荧光素酶表达系统等体外实验，解析蛇足石杉内生真菌合成石杉碱甲的生物途径，挖掘石杉碱甲合成的转录调控因子与表观调控因子，从而阐明蛇足石杉内生真菌的石杉碱甲生物合成与调控机制，为生物合成石杉碱甲奠定基础，从而解决自然资源不足的问题，实现资源的可持续发展。

石杉碱甲（Huperzine A, HupA）是我国自主研发治疗轻中度阿尔茨海默症的石松生物碱类药物，由于其化学合成技术体系不成熟，加之石杉类植物的人工栽培与组织培养困难，目前仅能从日益匮乏的野生千层塔等药用植物资源中微量提取，严重制约了其药物生产。本研究从千层塔中分离了两株具有合成石杉碱甲能力的千层塔内生真菌胶胞炭疽Cg01与波兰青霉hy4，且其含量均高于其它报道中内生真菌发酵液中的石杉碱甲含量。.对两株可产石杉碱甲的内生真菌Cg01与hy4进行全基因组测序。结果显示，hy4的基因组大小为32.35 Mb，平均GC含量约为46.9%，scaffold N50长度约4.0 Mb，N90约1.1 Mb，编码了11,696个基因；Cg01的基因组稍大，为53.19Mb，平均GC含量53.2%。，scaffold N50约1.7 Mb，N90约0.5 Mb，编码了17,713个基因。.通过比较基因组学与转录组学研究，两株内生真菌诱导后差异表达基因主要集中于碳氮代谢及核仁、核糖体及rRNA的加工。通过同源基因的差异表达分析，获得了一系列与石杉碱甲相关的合成候选基因，包括赖氨酸脱羧酶（LDC）、铜胺氧化酶（CAO）、聚酮合酶（PKS），以及调控候选基因，包括组蛋白赖氨酸N－甲基化转移酶（HMT）、组蛋白乙酰化转移酶（HAT）、组蛋白去乙酰化酶（HDAC）等。候选合成基因中，对候选基因进行单独基因敲除时，发酵液中石杉碱甲的含量均没有影响；而对LDC基因CgLDC1、CgLDC2进行同时敲除时，石杉碱甲含量显著上升（约83%）。候选调控基因中，突变体菌株△CgSAS-2的石杉碱甲含量无显著变化，而其它基因敲除突变体△Clr4、△CgClr3、△CgSir2-6的石杉碱甲含量与野生型相比，均显著性降低，分别降低了13.46%、22.26%、18.37%。.本研究推测，内生真菌的石杉碱甲合成途径与植物可能不同，内生真菌的HupA生物合成基因可能与植物机制共同进化；组蛋白修饰的HMT基因及HDAC基因参与了内生真菌的石杉碱甲合成调控。本研究首次报道在内生真菌中通过表观遗传修饰调控次生代谢产物的产生，为内生真菌中HupA的生物合成和调控提供了新的思路，对内生真菌中HupA的工业化生产具有重要意义。