致奶牛乳腺炎无乳链球菌cpsE/neuA介导细菌逃避NETs杀伤的分子机制

Serotype Ia Streptococcus agalactiae (Group B streptococcus, GBS) is one of the major causes of mastitis in dairy cattle causing huge economic losses for the industry. Researches demonstrated that neutrophils could release neutrophils extracellular traps (NETs) during GBS infection. However, the bacteria could survive on the environment surrounding neutrophils, which indicated that GBS could evade killing by NETs. Bacterial capsular polysaccharides (CPs) play vital roles in NETs evasion, however, the molecular mechanism remains unclear. In this study, GBS JSHA139 strain isolated from the milk of cow with subclinical mastitis is used to construct CPs deficient mutant (ΔcpsE) and sialic acid deficient mutant (ΔneuA). The capabilities of NETs induction of these three strains are analyzed to conform the functions of CPs, especially the roles of sialic acid in NETs evasion. Identifying the key receptors and signaling pathway responsible for CPs- and sialic acid-inducing NETs evasion. Evaluating the function of CPs and sialic acid in GBS induced mastitis. The results of above studies will provide new insight into the pathogenesis of mastitis and provide a theoretical basis for the design and development of mastitis vaccine in dairy herds.

Ia型无乳链球菌（GBS）是奶牛乳腺炎的重要病原，给奶业发展造成巨大的经济损失。研究发现GBS感染时机体释放嗜中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）捕获清除病原菌，但该菌仍可以在嗜中性粒细胞浸润的环境中持续存在，提示GBS可以逃避NETs的杀菌作用。研究发现荚膜在细菌逃避NETs杀菌过程中发挥重要作用，但具体机制尚不清晰。本研究拟以奶牛隐性乳腺炎分离株GBS JSHA139为研究对象，构建荚膜缺失株细菌(ΔcpsE)和荚膜唾液酸化缺失株细菌（ΔneuA），比较亲本株、ΔcpsE、ΔneuA诱导NETs形成能力，明确GBS荚膜帮助细菌逃避NETs杀菌方式，并解析唾液酸化修饰在其中发挥的作用；揭示与GBS荚膜及唾液酸化互作的细胞受体及激活的下游信号通路；评价GBS荚膜及唾液酸化修饰对乳腺炎疾病发展的影响。研究结果将有助于阐明GBS导致奶牛乳腺炎的致病机制，为奶牛乳腺炎疫苗的设计研发提供理论依据。

奶牛乳腺炎是奶牛最常发病，导致牛奶的产量和质量严重下降，并且该病也是治疗费用最高的疾病。无乳链球菌是引发奶牛乳腺炎的重要病原菌，可以导致隐性感染。中性粒细胞是先天性免疫的第一道防线，能迅速招募到感染部位发挥作用通过吞噬等多种作用清除病原微生物。当奶牛发生感染后嗜中性粒细胞的数目会急剧增多，研究无乳链球菌和嗜中性粒细胞之间的互作对细菌性乳腺炎的防治具有重要的作用。.奶牛乳腺炎GBS是否诱导嗜中性粒细胞释放NETs，其分子机制尚不清晰。本研究发现无乳链球菌SAG-FX17诱导NOX-ROS依赖性NETs形成，ROS诱导ERK1/2 MAPK信号通路的激活，进而诱导NETs的形成。ERK1/2 MAPK信号的激活可以进一步增强ROS的产生和NETs的释放。NETs对SAG-FX17具有清除作用。GBS在感染的过程中通过何种机制逃避NETs的杀菌作用仍需要进一步的研究。本研究中发现细菌感染的MOI可以通过调节嗜中性粒细胞的免疫反应从而提高细菌的存活能力，对奶牛乳腺炎的发展具有重要的作用。当低MOI时SAG-FX17可以ROS和NETs的形成，当高MOI时SAG-FX17可以抑制ROS和NETs的释放。进一步研究发现细菌在MOI=10发挥抑制作用时，细菌唾液酸转移酶基因cpsK转录水平显著提高，提示细菌在该感染比下荚膜唾液酸合成水平提高。并且嗜中性粒细胞SiglecE受体转录水平提高，提示感染过程中GBS可以激活抑制性受体负调控嗜中性粒细胞功能。本研究将纯化的细菌荚膜通过温和酸水解去除其唾液酸残基，比较正常荚膜与去除唾液酸荚膜诱导NETs形成的能力发现纯化的荚膜不能直接诱导NETs形成，并且荚膜本身具有诱导NETs形成正调控信号通路MAPK通路的活性，说明荚膜不是通过减弱嗜中性粒细胞正调控减少NETs的释放。荚膜预孵育细胞后可以抑制PMA诱导的ROS和NETs形成，并且当酸解唾液酸残基后，ROS和荚膜的抑制作用减弱。进一步研究含有唾液酸残基的荚膜诱导嗜中性粒细胞SiglecE受体转录水平显著提高，而酸解唾液酸残基的荚膜没有明显诱导SiglecE转录水平。SAG-FX17荚膜对致病菌引起的炎症均具有抑制作用。综上，SAG-FX17荚膜通过唾液酸化修饰激活抑制性信号通路负调控NETs形成。