麦芽糊精介导枯草芽孢杆菌ZJF-1A5高产中温α-淀粉酶机制研究

α-淀粉酶占据整个酶制剂市场的25%左右。有机碳源是决定其发酵产量的关键因素之一。我们前期研究发现麦芽糊精能够促进B. subtilis ZJF-1A5 高产中温α-淀粉酶。本项目拟在前期工作基础上，对麦芽糊精介导α-淀粉酶产量升高的分子机制进行研究。一方面从转录水平，通过构建敲除和过表达突变体等分子手段揭示麦芽糊精对糖酵解过程1,6-二磷酸果糖以及调控复合体 Hpr-CcpA或Crh-CcpA形成水平的影响，监测amyE的转录受阻遏情况，阐明麦芽糊精调控α-淀粉酶的分子机制；另一方面从转录后水平，特别是运输和折叠过程，通过western blotting等手段监测FtsY和PrsA的表达水平，探索麦芽糊精对PrsA催化折叠活性的影响，阐明麦芽糊精调控α-淀粉酶产生的机制。该机制的研究可以为发酵工艺碳源优化提供理论参考，同时有助于新型α-淀粉酶发酵菌株的育种。

淀粉酶占据整个酶制剂市场的 25%左右。有机碳源是决定其发酵产量的关键因素之一。我们前期研究发现麦芽糊精能够促进 B. subtilis 高产中温α-淀粉酶。本项目对麦芽糊精介导α-淀粉酶产量升高的分子机制进行以下研究：（1）利用基因重组技术，构建一种含有木糖启动子的重组枯草芽孢杆菌。试验中发现在2%木糖诱导条件可以增强重组枯草芽孢杆菌PaE中amyE的表达，而且麦芽糊精，可溶性淀粉，糖原和葡萄糖等碳源发酵产生的淀粉酶量几乎相同，说明α-淀粉酶启动子在麦芽糊精促淀粉酶产生的诱导效应中起到重要作用。（2）利用λ-red基因敲除技术对调节碳分解代谢阻遏（CCR）的全局调控因子编码基因CcpA以及Hpr的调控基因HprK进行敲除。研究发现这两个基因中任何一个基因敲除，淀粉酶的产量都会大幅提升，验证了淀粉酶的表达受到分解代谢阻遏调控。进一步结果表明这些基因敲除影响了枯草芽孢杆菌对某些碳源的利用能力，说明了CCR在枯草芽孢杆菌碳代谢中的地位。麦芽糊精对CcpA 和HprK缺失突变体的诱导效应都明显减弱，说明HprK-CcpA调控的CCR与糊精诱导α-淀粉酶产生的效应显著相关。（3）发现了不同碳源发酵枯草杆菌细胞中1,6二磷酸果糖的水平不同，糊精作为碳源时其细胞中1,6二磷酸果糖水平最低。通过添加2,6二磷酸果糖可以明显减弱枯草芽杆菌产α-淀粉酶的能力，而且糊精对α-淀粉酶的诱导效应也得到遏制。（4）克隆prsA基因整合到质粒pHT01上，在枯草杆菌中重新表达。研究发现过表达prsA的菌株产淀粉酶能力明显提高。通过破碎提取含有prsA的膜组分，我们研究了麦芽糊精、淀粉等组分对prsA折叠淀粉酶活性的影响。解折叠的淀粉酶在加入prsA后，活性恢复到原来的1/3左右。淀粉和糊精对淀粉酶活性恢复程度的影响不显著，说明它们对prsA折叠淀粉酶的能力没有影响。综上所述，转录水平上的调控是麦芽糊精诱导淀粉酶高产的主因。麦芽糊精可通过影响HprK来调控CcpA，最终缓解了分解代谢阻遏现象，因此促进了淀粉酶的高产。通过构建淀粉酶重组表达菌株可以消除不同碳源对淀粉酶产量的影响。但是由于分泌胁迫的存在，其最大产酶的能力仍受到限制。我们的研究结果支持构建AmyE-prsA-FtsY重组枯草芽孢杆菌菌株，预期其α淀粉酶的生产能力将大幅提高。