miR-106b～25簇靶向Smad7、Smad6、BAMBI抑制结肠癌肝转移的研究

Liver metastasis is the major cause of colon cancer mortality. Therefore, elucidating the molecular pathways essential for tumor metastasis is an important way to improve survival rate. Several data suggest miR-106b～25 cluster(including miR-106b,miR-93 and miR-25) as an oncogene improved the proliferation of several cancers. However, the role of this cluster in colon cancer is still unreported. Our previous research found that miR-25 inhibited the proliferation and metastasis of colon cancer cells through decreasing the expression of Smad7. And Smad6 and BAMBI were predicted as miR-106b～25 cluster target genes in silico. Because Smad7,Smad6 and BAMBI mediate the cross-talk among TGF-β, BMP and Wnt/β-catenin signaling.We speculate miR-106b～25 cluster inhibits liver metastasis of colon cancer through these signaling pathways.In this study, we will verify this hypothesis by luciferase report system, gain of function or loss of function,in vivo imaging and other molecular biology technologies in vitro,in vivo and in clinic samples. This study will give the mechanism of liver metastasis of colon cancer from new visual angle, and provide new idea and new target for estimating prognosis and treatment of the colon cancer patients.

结肠癌肝转移是导致结肠癌患者死亡的主要原因，阐明其分子机制是改善预后的根本途径。有研究表明，miR-106b～25簇（由miR-106b、miR-93和miR-25组成）与多种肿瘤增殖相关，但在结肠癌转移中的作用尚未见报道。我们前期研究发现miR-25能通过靶基因Smad7抑制结肠癌细胞的增殖和迁移，并通过相应软件预测Smad6、BAMBI也是该簇的靶基因。鉴于Smad7、Smad6、BAMBI是TGF-β、BMP、Wnt/β-catenin通路的重要节点，我们推测miR-106b～25簇通过上述通路抑制结肠癌的肝转移。本课题拟利用荧光素酶报告系统、基因过表达和敲减、小动物活体成像及其他分子生物学技术，在体内外动物实验及临床病理标本的检测中验证该假说的成立。本研究将从新的视角揭示结肠癌肝转移的机制，为其预后判断和治疗提供新思路和新靶点。

目的： 研究miR-106b~25簇抑制结直肠癌肿瘤增殖及转移作用的分子机制。方法： qRT-PCR检测人结肠癌组织和细胞中miR-106b~25簇各成员表达情况。构建miR-106b~25簇表达载体。瞬转miR-106b~25簇及成员microRNA mimic和相应inhibitor实现过表达及敲减。用细胞迁移芯片培养板在实时细胞监测仪（RTCA）的迁移实验和Transwell实验观察该簇对结肠癌细胞的迁移和侵袭能力的影响；应用RTCA的增殖监测、MTT实验和克隆形成实验检测该簇对结肠癌细胞增殖能力的影响。生物信息学软件预测该簇的靶基因Smad7、Smad6、BAMBI。qRT-PCR和Western blot检测该簇对靶基因表达的影响。荧光素酶活性实验验证靶基因与miR-106~25成员的靶向关系。生物信息学方法及表达水平筛选预测miR-106b~25与 Wnt/β-catenin信号通路相关，qRT-PCR检测Wnt/β-catenin信号通路受miR106b~25调控情况。Western blot及免疫荧光法检测该簇对β-catenin蛋白水平的调控作用。免疫组化法检测靶基因Smad7、Smad6、BAMBI及β-catenin在结肠癌组织中的表达情况。结果： miR-106b~25簇在结肠癌组织中呈低表达。miR-106b~25簇可以抑制结肠癌侵袭、迁移及增殖能力。其中miR-106b显著抑制侵袭和迁移，miR-93和miR-25对增殖能力抑制显著。敲减miR-93可以增强HCT116的增殖和克隆形成能力。荧光素酶活性实验证实miR-106b~25簇均可靶向Smad7，而BAMBI和Smad6分别与miR-106b和miR-93存在靶向关系。通过核酸及蛋白水平检测该簇对β-catenin、axin、c-myc和cyclinD1表达影响的分析，提示miR-106b~25簇能下调Wnt/β-catenin通路。结论： miR-106b~25簇能够抑制结肠癌的侵袭、迁移和增殖能力。该簇可能通过靶向Smad7抑制Wnt/βcatenin信号通路传导，同时伴随该簇对其他靶点Smad6和BAMBI的调控，提示miR-106~25簇可能参与了多靶点的网络调节最终在结肠癌中发挥了抑制肿瘤发生的作用。因此，miR-106b~25簇可能成为结肠癌治疗潜在的新靶点