山豆根多糖通过microRNA-140-5p调节氧化应激与自噬拮抗对乙酰氨基酚肝损伤的机制研究

Acetaminophen (APAP)-induced liver injury is the most common cause of acute liver failure. STRP1 is the new active ingredient of polysaccharide isolated from Sophorae tonkinensis radix. STRP1 can significantly alleviate APAP-induced liver injury, but its mechanism of action remains unclear. Recent studies show that remarkable up-regulation of miR-140-5p was found in the liver tissue of APAP-injured mice, and STRP1 can noticeably down-regulate the expression of miR-140-5p and up-regulate the expression of Nfr2 and Beclin1 in the liver tissue of APAP-injured mice. Therefore, it was hypothesized that STRP1 antagonized APAP-induced liver injury by down-regulating the expression of miR-140-5p, activating Nrf2-mediated Nrf2-Keap1 pathway and Beclin1-mediated autophagy. To confirm this hypothesis, in vitro and vivo APAP-induced liver injury models were established, coupled with the adoption of molecular and cellular biology, to verify the involvement of STRP1 in APAP-induced liver injury via miR-140-5p-Nrf2 and miR-140-5p-Beclin1. This study will not only provide novel targets and candidate drugs for the treatment of APAP-induced liver injury, but also provide theoretical and experimental basis for the development of Sophorae tonkinensis radix.

对乙酰氨基酚（APAP）引起的肝损伤，是造成急性肝衰竭的最常见原因。STRP1是从山豆根中分离得到的一个新的多糖活性成分。前期研究发现STRP1可以明显减轻APAP肝损伤，但作用机制尚不明确。最近我们发现APAP损伤小鼠肝组织中miR-140-5p表达上调，STRP1能显著降低miR-140-5p的表达，上调Nfr2、Beclin1的表达。因此，我们推测STRP1通过下调miR-140-5p的表达，激活Nrf2介导的Nrf2-Keap1通路与Beclin1介导的自噬，从而拮抗肝损伤。为证实这一假说，我们在整体和细胞水平构建APAP肝损伤模型，采用分子和细胞生物学手段，探讨STRP1通过miR-140-5p-Nrf2和miR-140-5p-Beclin1信号通路对APAP肝损伤的影响。本研究不仅为治疗APAP肝损伤提供新的靶点和候选药物，也为山豆根的开发提供理论与实验基础。

药物性肝损伤（DILI）是应用治疗剂量的药物时，肝脏受药物毒性损伤或发生过敏反应所引起的疾病，其中对乙酰氨基酚（APAP）引起的肝损伤（AILI）是造成急性肝衰竭的主要因素，已引起严重的公共健康安全问题。N-乙酰半胱氨酸（NAC）是被美国FDA批准用于治疗AILI的唯一药物，但是NAC半衰期短，且有较多不良反应。因此，亟需寻找安全有效的替代治疗药物。STRP1是申请人从山豆根中分离、纯化得到的一个新的多糖活性成分，我们前期研究发现STRP1具有减轻AILI的作用，但是其作用机制尚不明确。氧化应激与自噬与机体内多种疾病的发生发展密切相关，已有研究发现调节氧化应激与自噬水平可以拮抗肝损伤。因此，我们认为STRP1减轻肝损伤的作用机制可能是调节氧化应激与自噬水平。本项目采用HepaRG细胞与小鼠为研究对象，建立APAP体外、体内肝损伤模型，应用HE染色法、荧光探针法、流式细胞术、qRT-PCR技术、WB技术、双荧光素酶报告基因技术等研究手段，并施以基因的沉默与过表达等干预手段，研究STRP1是通过miR-140-5p调节氧化应激与自噬拮抗APAP 肝损伤的作用机制。本项目的研究结果表明：与模型组相比，STRP1能显著改善肝损伤小鼠的肝组织病变，降低肝损伤小鼠与细胞中ALT、AST、LDH、MDA、ROS水平，明显提高抗氧化酶（SOD、CAT、GPx）水平；WB的结果表明，STRP1能提高Nrf2、HO-1、NQO1、Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ水平，降低Keap1、P16、P62水平。此外，miR-140-5p激动剂能进一步加重这些趋势，miR-140-5p拮抗剂能逆转这样的趋势。双荧光素酶报告基因的结果表明：Nrf2是miR-140-5p的靶基因，但是Beclin1不是miR-140-5p的靶基因。综合上述研究结果，我们证实立项初提出的假设：(1) STRP1通过下调miR-140-5p的表达，上调 Nrf2的表达，激活 Nrf2-Keap1通路，起到抗氧化应激的作用，从而减轻肝损伤（2）STRP1通过下调miR-140-5p的表达，上调自噬相关蛋白的表达，激活自噬。但是miR-140-5p调节自噬的作用机制还没有明确，有待我们进一步研究。本项目为山豆根多糖的临床应用提供科学依据，也为治疗AILI提供新的思路。