绵羊新抗微生物多肽基因的筛选、酵母表达及抗性分析

抗生素耐药性问题日益严重，寻找新的抗感染物质应用于畜牧业具有重要的现实意义。绵羊中虽然已经发现几种抗微生物多肽基因，但仍存在一些未知抗微生物多肽基因有待发现，其生物学功能有待证实。本研究通过同源序列探针杂交已经建成的脂多糖（LPS）诱导的绵羊肺泡巨噬细胞cDNA文库，筛选新的绵羊抗微生物多肽基因，PCR扩增完整的基因编码区（cDS），利用基因工程方法在酵母中诱导表达新发现的绵羊抗微生物多肽，经分离纯化后通过细菌抑制试验确定其抗微生物活性和抗菌谱，揭示其抗感染生物学功能。本项研究为抗感染药物研发奠定基础。

绵羊养殖业是新疆畜牧业的经济产业之一, 由于传统的抗生素药物应用已经产生了严重的耐药性问题，且在肉食品中存在残留，已不能满足临床和生产的需要，发展新的抗微生物药物已经破在眉睫。抗微生物多肽是机体天然免疫的重要物质，具有广普的抗微生物活性，对多种病原微生物甚至病毒都有一定的杀伤力，是新一代抗微生物药物的理想选择。肺泡巨噬细胞是肺部抵抗感染的第一道防线，绵羊肺泡巨噬细胞是否存在抗微生物多肽尚未见报道，抗微生物多肽的生物学功能还不清楚，寻找绵羊抗微生物多肽并弄清其功能具有重要意义。 .本项研究通过设计抗微生物多肽基因保守区序列简并性引物和杂交探针，对LPS诱导的绵羊肺泡巨噬细胞cDNA文库进行PCR和杂交探针筛选，对筛选的文库克隆进行测序分析，获得EST序列后进行5’-RACE，获得全长基因序列，经过比对和分析表明，获得2个绵羊中新发现抗微生物多肽基因NK-lysin和Leap。为了更全面了解绵羊肺泡巨噬细胞中天然免疫相关基因的信息，对脂多糖（LPS）诱导的绵羊肺泡巨噬细胞进行了转录组高通量测序，以未诱导为对照，诱导7h为试验组，获得了脂多糖诱导后绵羊肺泡巨噬细胞的全部转录组序列和差异表达基因序列，通过对cDS编码序列的比对和筛选，获得绵羊肺抗菌肽基因（LAP）、抗菌肽SC5和BAC5编码基因序列。从而证实绵羊肺泡巨噬细胞有多种抗微生物多肽参与天然免疫。为了进一步证实抗微生物多肽在组织中的分布和表达情况，我们对部分绵羊抗微生物多肽基因在绵羊体内的表达分布和组织丰度进行了检测，为抗微生物多肽的抗病机理研究提供了依据。.选取绵羊抗微生物多肽NK-lysin、leap、LAP和绵羊粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因，构建重组酵母表达质粒pPIC9K-NK-Lysin、pPIC9K-leap、pPIC3.5K-LAP和pPIC9K-GM-CSF，将构建重组表达质粒经线性化后电击转移至酵母菌中诱导表达，表达产物LAP纯化后表现出抗微生物活性。构建原核表达重组载体pet32a-NK-Lysin，pet32a-leap、pet32a-GM-CSF转化至大肠杆菌中诱导融合蛋白表达，纯化后NK-Lysin表现出抗微生物活性，GM-CSF具有促进淋巴细胞增殖的功能。本项研究抗微生物多肽基因的表达和纯化申请了专利，为进行抗微生物多肽类药物研发奠定基础。