基于AMPK-KATP-NF-κB信号通路的三七总皂苷抗心肌缺血再灌注炎症反应的分子机制研究

Inflammatory response is a crucial mechanism in myocardial ischemia-reperfusion (I/R) injury, regarded as the key link to myocardial damage. We confirmed that anti-inflammatory response is one of the cardioprotection mechanisms of tradition Chinese medicine(TCM), which can activate blood circulation and remove stasis, to against I/R injury previously. AMPK, KATP, NF-κB play important roles in myocardial ischemia-reperfusion injury and inflammation respectively. The latest reports showed that there were interesting links between two of them, but the relation in the three and the regulation of TCM on them remain unknown. In this project, molecular mechanisms of panax notoginseng saponins(PNS) against myocardial ischemia reperfusion and inflammatory response will be investigated based on the AMPK-KATP-NF-κB signal pathway. The changes and relations of these three proteins in cardioprotection of PNS will be observed from in vivo and in vitro(cell) levels by pharmacological methods, patch clamp, Elisa and western blot, real-time fluorescent quantitative PCR, nucleoprotein extraction and EMSA technology. This study will provide new targets of PNS against inflammatory response induced by myocardial I/R injury, and provide theoretical and experimental bases for clinical application in prevention and regulation myocardial I/R injury also.

炎症反应贯穿于心肌缺血再灌注(I/R)损伤的全过程，被视为损害心肌的关键中介环节。我们前期工作证实抗炎是活血化瘀类中药对I/R心肌发挥保护作用的机制之一。AMPK、KATP、NF-κB三种蛋白质在心肌缺血再灌注损伤及炎症反应中各自具有重要作用，最新文献显示，它们两两之间有着一定的联系，但目前未有研究I/R中三者上下游关系及中药对三者之间联系的调控作用的报道。本项目拟从AMPK-KATP-NF-κB信号通路角度探讨三七总皂苷(PNS)抗心肌缺血再灌注引起的炎症反应的作用机制，运用药理学方法，采用膜片钳、Elisa、western blot、实时荧光定量PCR、核蛋白提取、EMSA等技术，从整体和细胞两个水平展开研究，解析这三种蛋白质组成的通路在PNS抗I/R心肌炎症反应中的变化和作用。本研究将为PNS的抗心肌I/R损伤作用增加新的靶点，也为临床应用PNS防治心肌I/R损伤提供理论与实验依据。

炎症反应贯穿于心肌缺血再灌注（I/R）损伤的全过程，被视为损害心肌的关键中介环节。我们前期工作证实抗炎是活血化瘀类中药对I/R心肌发挥保护作用的机制之一。AMPK、KATP、NF-κB三种蛋白质在心肌缺血再灌注损伤及炎症反应中各自具有重要作用，它们两两之间有着一定的联系，但目前未有研究I/R中三者上下游关系及中药对三者之间联系的调控作用的报道。本项目从AMPK-KATP-NF-κB信号通路角度探讨了三七总皂苷（PNS）抗心肌缺血再灌注引起的炎症反应的作用机制，通过整体和细胞两个水平的研究，证明这三种蛋白质组成的通路在PNS抗I/R心肌炎症反应中的变化和作用。.实验证明，PNS能够改善I/R后的血流动力学和心肌力学指标（±dp/dtmax、t-dp/dtmax、DP、mLVSP、mLVDP等），对抗再灌注造成的心功能降低；减轻I/R后的心肌病理变化，减少炎性细胞浸润，降低心肌MPO活性，抑制炎性细胞因子TNF-α、MCP-1的基因与蛋白表达，从而抑制再灌注心肌的炎症反应。PNS的抗I/R损伤作用与AMPK、KATP、NF-κB三种关键蛋白质密切相关，表现为促进AMPK的表达和磷酸化、增加KATP的表达与功能、抑制NF-κB的磷酸化与入核（减少再灌注心肌细胞核内p-NF-κB表达和胞浆内p-IκBα表达，免疫荧光显示NF-κB入核减少），AMPK抑制剂Compound C和非选择性KATP通道阻断剂Glibenclamide能够阻断PNS的上述心肌保护效应，特异性线粒体KATP阻断剂5-HD能够部分阻断PNS的作用。通过药理学方法证明，AMPK、KATP和NF-κB之间存在上下游关系，AMPK激动剂AICAR对KATP表达和NF-κB的磷酸化和入核皆有调控作用，Glibenclamide阻断KATP能促进NF-κB激活与入核，而NF-κB抑制剂BAY-117082对KATP表达无明显作用，说明在I/R心肌存在AMPK-KATP-NF-κB通路，而调控此通路是PNS抗心肌I/R损伤和炎症反应的分子机制之一。.本研究证明，AMPK-KATP-NF-κB通路是PNS抗心肌I/R损伤的分子机制与靶点之一，为临床应用PNS防治心肌I/R损伤提供了理论与实验依据。