自噬在内皮祖细胞促进血栓机化再通中的作用研究

自噬在细胞的生长、发育和疾病发生中起着重要的作用，与血管生成也有着密切的联系，而探讨自噬在深静脉血栓中扮演的角色及作用机制，是研究深静脉血栓发生发展机制中的一个新思路。本课题是深静脉血栓研究的重要组成部分，我们在前期成功诱导培养鉴定EPCs，体内移植EPCs能加快血栓机化再通的基础上探讨：1.自噬的抑制与激活对内皮祖细胞的生存作用影响；2.Ⅲ型PI3K特异性阻断剂Baflomycin A对HUVECs（人脐静脉内皮细胞）增殖作用及微血管形成的作用影响；3.探讨自噬/溶酶体参与内皮细胞增殖的分子机制。

背景：深静脉血栓是血管外科多发病, 慢性期可导致血栓后综合征，治疗困难。血栓的机化和再通是血栓内新生毛细血管形成的过程。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)是可以分化为成熟内皮细胞的一类干细胞群。研究表明，EPCs参与各种生理及病理性血管新生。在前期的工作中我们培养大鼠骨髓源性EPCs，并将EPCs移植到静脉血栓大鼠体内，移植细胞组血栓内毛细血管数目明显高于对照组，表明EPCs能加速血栓的机化和再通。方向：EPCs促进加速血栓机化再通为慢性深静脉血栓的治疗提供了一个新的思路。但实验中存在诸多问题，如EPCs增殖迁移能力差，细胞移植需要量大，细胞易老化，细胞在体内增殖慢，存活量少，血栓部位血管内皮细胞凋亡在增加，局部炎症持续时间长等。目前研究发现血管生成与自噬密切相关，雷帕霉素能降低外周血EPCs的数量及功能。我们推测其原因是雷帕霉素诱导细胞自噬的发生，过度自噬导致细胞损伤，而一定程度的自噬调节，或许能促进细胞增殖或凋亡。主要内容：在本课题中，我们采用激活及抑制自噬两种途径，观察两种干预对EPCs的生存影响及探讨自噬在血栓机化再通中的作用。结果：（1）随雷帕霉浓度增加EPCs增殖率逐渐降低甚至死亡，凋亡率和自噬增加。（2）低浓度3-甲基腺嘌呤(3-methlyadenine, 3-MA)对EPCs的增殖及凋亡无明显影响，5mmol/l组对EPCs有增殖促进作用，10mmol/l组抑制EPCs增殖并促进EPCs凋亡并影响细胞周期的分布。（3）自噬激活能抑制人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells, HUVECS）的增殖、促其凋亡；调控自噬可影响细胞因子的表达水平。（4）激活自噬可使Lamp-2a表达升高，上调CMA，LC3-II表达减少。抑制自噬下调CMA，大自噬活性增强。CMA和大自噬之间表现出功能互补的关系。（5）移植EPCs到大鼠慢性深静脉血栓体内，雷帕霉素干预组可影响EPCs在体内存活，且呈剂量相关性，并影响血栓内部的毛细血管密度；一定浓度的3-MA可提高EPCs在血栓内部的存活率，并可提高血栓内部毛细血管密度。意义：（1）自噬调节可影响EPCs增殖及凋亡，进而可能会影响血管生成（2）可通过调控自噬调节血栓的机化再通（3）干细胞的自噬及凋亡或许是靶向治疗的新方向。