七叶皂苷钠调控NOX家族蛋白介导的MAPK、PI3K/AKT信号通路保护神经细胞氧化应激损伤

Sodium aescinate is the triterpenoid saponins sodium salt extracted from Aesculus Chinese Buckeye Seed, trade name Reparil. Clinically it can reduce exudative, improve circulation, and promote the recovery of brain function. Experiments prove that it can improve the activity of SOD. But whether sodium aescinate can change the oxidative stress status of the nerve cells, treat neurodegenerative diseases as well as the specific molecular mechanisms and biological targets is unclear. The applicant recently found that sodium aescinate can decrease the PC12 cells growth inhibition rate and apoptosis rate in H2O2 injury model. Furthermore, sodium aescinate can improve the apoptotic morphological changes of the nucleus and reduce the intracellular ROS level. In the present program, we will investigate the impact of sodium aescinate in H2O2-induced PC12 cell and primary cortical cells injury as well as the signal transduction and clarify the specific molecular mechanism. The project includes building PC12 cells and primary cortical cells oxidative stress models, the regulatory effect of sodium aescinate on H2O2-induced apoptosis and ROS level in nerve cells, the MAPK and PI3K/AKT cell survival pathway and AP-1 transcriptional activity. In addition, we probe ROS generation subcellular localization and interrelated enzyme，determine the NOX family proteins are the key factor of the cytoprotective effects and the precise regulatory mechanism of NOX family proteins.

七叶皂苷钠是娑罗子中提取的三萜皂苷钠盐，商品名Reparil，临床用于抗渗出、改善循环、促进脑功能恢复。研究证明其能提高SOD活性，但七叶皂苷钠能否改变神经细胞的氧化应激状态，治疗神经退行性疾病，其保护神经细胞的具体分子机制和生物标靶尚不清楚。申请者在PC12细胞H2O2损伤模型中发现，七叶皂苷钠能够降低H2O2引起的细胞凋亡，改善细胞核凋亡形态学变化，减少细胞内ROS的生成。本项目将深入分析七叶皂苷钠对PC12细胞和原代大脑皮层细胞的H2O2损伤保护及相关信号转导的影响，阐明具体的分子机制。主要包括：1)构建PC12和原代大脑皮层细胞氧化应激模型；2）降低H2O2引起的细胞损伤和细胞内ROS水平；3) 对MAPK和PI3K/AKT信号通路和转录因子AP-1转录活性的影响；4）细胞内ROS生成的亚细胞定位及生成酶；5）NOX家族蛋白是细胞保护作用的关键因子；6）对NOX家族蛋白的调控机制。

ROS是生物体有氧代谢过程中产生的一类活性含氧化合物的总称，具有很高的反应活性。线粒体是多数真核细胞产生ROS的主要部位，其次NADPH氧化酶也是产生ROS的主要来源。过度产生的ROS通过直接参与细胞信号或者通过调节氧化还原状态来控制细胞信号转导通路，从而调节相关基因的表达，引起机体多种病理变化，如细胞增殖、神经损伤、炎症和血管内皮功能障碍等。本项目通过研究ROS相关信号转导网络，以期更深入了解神经退行性疾病、癌症发生及炎症形成等过程中ROS所发挥的生物学功能。临床化学药物的毒副作用大，易产生抗药性，而植物中提取的天然药物在这方面具有无可比拟的优势。我国是植物资源十分丰富的国家，拥有几千年的中药使用历史，使天然药物的开发极具前景。我们开展了大规模基于ROS相关信号活性调节的小分子天然提取物的筛选，并对其调控ROS信号的靶点机制展开深入研究，使其成为ROS信号机制与功能研究的工具药，或者为临床相关疾病治疗药物的开发提供依据。本项目取得的重要结果主要有：1. 七叶皂苷钠的神经保护和抗肿瘤作用机制。① 七叶皂苷钠通过清除H2O2诱导的PC12细胞内ROS生成，进而抑制ERK和p38的激活，降低H2O2对神经细胞的损伤，发挥细胞保护作用。② 七叶皂苷钠通过抑制Akt和ERK活化，上调死亡受体DR4和DR5水平，抑制细胞增殖，促进宫颈癌Hela细胞凋亡。③ 七叶皂苷钠通过抑制Src的活化，阻断下游信号分子Akt和ERK的活化，抑制乳腺癌细胞MCF-7增殖，诱导细胞凋亡。④ 七叶皂苷钠通过抑制JAK1/STAT1磷酸化及STAT1入核，抑制胃腺癌BGC-823细胞和胃癌AGS细胞增殖并诱导其凋亡。2. 杨梅苷的抗炎机制。杨梅苷通过抑制NADPH氧化酶家族成员p47phox向细胞膜募集与gp91phox形成复合物，降低RAW264.7细胞内LPS诱导的ROS生成，抑制JAK2/STAT1信号通路的活化，抑制转录因子STAT1入核及转录活性，降低炎症相关细胞因子TNF-α，IL-6，MCP-1和NO的分泌，抑制炎症蛋白iNOS蛋白的表达，发挥抗炎作用。3. 荭草苷的神经保护作用机制。荭草苷通过抑制H2O2诱导的PC12细胞内ROS的生成，阻断Src的活化，进而抑制其下游信号分子MAPKs和Akt的磷酸化，降低H2O2诱导的PC12细胞损伤，发挥神经细胞保护作用。4. 双氢杨梅素的抗