放射性同位素测量miRNA在肿瘤的表达及SPECT显像研究

miRNA通过与靶基因3'非翻译区（3'-UTR）互补结合而调节其表达，与肿瘤发生关系密切。准确测量其在肿瘤细胞和组织的表达具有重要意义，但现有方法操作复杂、无法进行活体监测。本研究利用 miRNA调节靶基因表达的原理, 以人钠/碘泵(hNIS)作为报告基因，以let-7与其靶基因ras 基因作为研究对象，通过连接hNIS与ras基因3'-UTR并将其置于肿瘤特异性启动子hTR下游，构建能在肿瘤特异表达并受let-7调节的hNIS基因。根据hNIS介导摄取99m-Tc的特征，用放射性同位素测量报告基因在肿瘤细胞的表达, 并对其在肿瘤组织的表达进行SPECT显像研究。本研究将建立新的、高灵敏测量miRNA在细胞表达的同位素方法, 为miRNA 的深入研究奠定基础; 通过核医学方法对miRNA在肿瘤组织的异常表达进行可视化研究, 建立以miRNA为肿瘤标志物对肿瘤进行核医学显像的研究。

依据miRNA与靶基因3’-UTR互补结合而调节靶基因表达原理，本研究以人钠/碘转运体（hNIS）作为报告基因，分别克隆hNIS及可与let-7 互补结合的ras 基因的3’-UTR的序列（RU），连接构建受let-7调控的融合基因（hNIS-RU）。将hNIS及hNIS-RU分别转染A549细胞，24小时后于培养液中分别加入25uCi的131I。由于131I可通过切伦科夫辐射产生光信号，分别对培养细胞进行放射性同位素测量，γ显像及切伦科夫显像（CLI），结果转染hNIS的A549的131I摄取明显增高，是未转染A549 的12倍； 转染hNIS-RU的A549细胞131I的摄取减低，为转染hNIS的70%，是未转染A549 的8倍，放射性同位素测量，γ显像及切伦科夫显像对131I摄取测量具有良好的相关性。为进一步验证该法的特异性，克隆与RU特异结合的前体let-7(pri-let-7)及不与RU特异结合的前体mir-143(pri- mir143)，并将hNIS-RU分别与不同量的pri-let-7或pri- mir143共转染A549细胞，加入131I分别进行放射性同位素测量，γ显像及CLI，A549细胞共转染hNIS-RU 与pri-let-7后，其对131I的摄取随pri-let-7的增加而降低；而共转染hNIS-RU与pri-mir143后，A549细胞对131I的摄取基本不变，表明该法具有较高的特异性。筛选稳定转染的hNIS及hNIS-RU A549细胞，接种裸鼠制备动物模型，注射200uCi 99mTcO4-后1、2、4、12小时分别进行γ显像，并于相应时间点处死荷瘤裸鼠，测量各脏器放射性分布。结果转染hNIS-RU部位肿瘤显影。体内生物学分布显示2小时肿瘤显影清晰转染hNIS-RU的T/NT比值为2.87。.本研究依据miRNA与靶基因3’-UTR互补结合而调节靶基因表达原理，构建受let-7调控的融合基因（hNIS-RU）。利用hNIS介导摄取131I或99mTcO4-，成功对A549细胞及表达let-7进行了同位素测量与显像，并对A549肿瘤let-7表达进行了核素显像。该研究初步建立了以hNIS为报告基因，测量miRNA在肿瘤细胞或组织表达的高灵敏的放射性同位素新方法，既为miRNA的深入研究奠定了方法学基础，也为肿瘤的诊