蛋白质磷酸化状态调节荷脂细胞胆固醇跨膜转运方向的分子机制及姜黄素的作用

本项目在申请人以往研究荷脂细胞胆固醇跨膜转运调控规律的基础上，提出"annexin2、hsp56和caveolin-1三种蛋白质的磷酸化状态调节胆固醇酯（CE）转运复合体和胆固醇（CH）转运复合体之间的相互转化、进而调节细胞脂质跨膜转运及胞内脂质平衡"的学术思想。通过应用Dil荧光标记、[3H]标记、HPLC、激光共聚焦、免疫印迹、SiRNA、磷酸化位点突变、蛋白质PullDown等传统和现代分子生物学技术，分别探讨annexin2、hsp56和caveolin-1三种蛋白质的磷酸化状态对CE和CH两种转运复合体形成、运动、转换和功能的影响，并初步阐明其调节规律。同时研究姜黄素调节上述三种蛋白质的磷酸化状态和CE/CH复合体之间的转化，促进荷脂细胞脂质的外向跨膜转运，进而抗动脉粥样硬化（As）的作用机制。为阐明As的斑块消退原理和以胆固醇跨膜转运为靶点开发新型抗As药物提供理论及实验依据。

动脉粥样硬化以内膜下脂质沉积和单核巨噬细胞、血管平滑肌细胞蓄脂泡沫化为主要病理特征。其中蓄脂细胞的胞内脂质稳态失衡是动脉粥样硬化的始动因素。我们研究了胆固醇（酯）转运复合体相关蛋白分子的磷酸化状态对血管平滑肌细胞和巨噬细胞脂质蓄积程度的影响。利用蛋白酪氨酸磷酸化酶抑制剂sodium orthovanadate及siRNA方法调节细胞内蛋白磷酸化状态，观察血管的损伤、修复情况。利用caveolin-1敲除小鼠检测动物血脂、动脉粥样硬化斑块形成情况。利用caveolin-1高表达载体或siRNA调节caveolin-1蛋白表达水平，分析对血管平滑肌细胞和巨噬细胞蓄脂程度的影响。利用姜黄素及其衍生物处理apoE敲除小鼠或蓄脂细胞，检测其抗动脉粥样硬化作用和阻止细胞蓄脂的能力。结果显示，1）蛋白酪氨酸磷酸化可增强受损血管的修复新生能力，而抑制蛋白酪氨酸磷酸化可导致血管生成受阻。2）caveolin-1敲除后小鼠血脂升高，动脉粥样硬化斑块面积增大。3）在细胞内，caveolin-1表达水平与细胞蓄脂程度呈反相关性。4）姜黄素及其衍生物显示出较好的抗动脉粥样硬化效果，其分子机制可能与调节caveolin-1的表达有关。此外，我们还拓展了相关研究领域：5）发现caveolin-1和姜黄素能上调收缩蛋白表达，增强血管收缩力。6）证实了姜黄素能调节炎症因子表达，具有抗炎作用。