激活TRPV1通过TFEB介导的骨骼肌细胞脂自噬调控胰岛素敏感性的机制

Lipid toxicity induced by ectopic fat deposition contributes to the development of insulin resistance. However, it lacks effective prevention. Lipid autophagy contributes to the intracellular lipolysis. Transcription factor EB (TFEB) is a master regulator of autophagy and mitochondrial function, which can be affected by calcium signals. It is reported that transient receptor potential vanilloid subtype 1 (TRPV1) is related to lipid autophagy in hepatocytes and vascular smooth muscle cells. But it is unknown whether TRPV1 channel in skeletal muscles is related to lipid autophagy. We previously discovered that dietary capsaicin ameliorated high fat-diet induced skeletal muscle lipid deposition and insulin resistance, but the mechanism was unclear. Recently we found in vitro that capsaicin upregulated the expression of TRPV1 and lysosome markers and the protein level of nuclear TFEB. Thus, we suppose that TRPV1 activation regulate insulin sensitivity through TFEB-mediated lipid autophagy in skeletal muscles. This project is designed to prove the above hypothesis. It may offer new targets and strategies for the prevention and control of insulin resistance.

脂质异位沉积产生的脂毒性是胰岛素抵抗的重要原因，但缺乏经济有效的防治措施。脂自噬参与脂滴的分解代谢，转录因子 EB(TFEB)是调控脂自噬全程的关键分子。肝细胞上的瞬时受体电位香草醛亚型1(transient receptor potential vanilloid subtype 1, TRPV1)与脂自噬相关，而骨骼肌TRPV1是否如此还不清楚。我们前期发现，辣椒素可减轻骨骼肌脂质沉积和胰岛素抵抗，机制尚未明确。最近我们对骨骼肌细胞研究发现，辣椒素可上调TRPV1、溶酶体标志物表达及细胞核TFEB含量，因此推测辣椒素可能通过TRPV1/TFEB/脂自噬通路改善胰岛素敏感性。本项目拟用大鼠及基因敲除型小鼠，培养的骨骼肌细胞，用高脂、辣椒素模拟膳食因素，探索TRPV1/TFEB/脂自噬通路在胰岛素敏感性调控中的作用及机制，为胰岛素抵抗早期防治提供新的靶点和策略。

过多脂质在骨骼肌等非脂肪组织的异位沉积是胰岛素抵抗和糖脂代谢紊乱的重要原因之一，近来研究发现自噬参与调控脂代谢，但具体影响和机制不明确，且缺乏安全有效的干预措施。本项目主要以长期高脂饮食诱导的骨骼肌脂质堆积小鼠及棕榈酸诱导的脂质沉积骨骼肌细胞为模型，采用代谢笼、同位素掺入、组织病理学、基因组学、细胞分子技术明确表型和基因变化，利用基因敲除、RNAi、拮抗剂等探索信号通路。.研究发现，饥饿及单次有氧运动后，高脂饮食的小鼠脂肪酸氧化能力和骨骼肌自噬出现明显障碍。高脂组骨骼肌TFEB mRNA及蛋白表达降低，LAMP1降低，Sqstm1/P62蛋白升高（与mRNA相反），p-TFEB及PLIN2升高，添加辣椒素能逆转野生型的变化，但对TRPV1敲除型小鼠无效。免疫荧光显示自噬标记物LC3与骨骼肌脂质共存。提示长期高脂饮食引起骨骼肌脂质和自噬体的清除受损，辣椒素能通过TRPV1受体逆转上述影响。细胞实验发现辣椒素显著提高骨骼肌细胞脂肪酸氧化能力和自噬流，TRPV1拮抗剂及溶酶体抑制剂能显著减弱辣椒素的作用。辣椒素可上调TFEB及其下游溶酶体相关基因表达，能促进TFEB向核内转移，增加TFEB与“CLEAR”序列的结合，而同时用TRPV1拮抗剂capsazepine或钙调神经素抑制剂环孢素A处理能抑制辣椒素的作用。电镜证实辣椒素与棕榈酸共处理的肌细胞可见较多包含脂滴及其他物质的双层膜或单层膜结构。Co-IP证实自噬受体P62能与脂滴包被蛋白PLIN2结合。TFEB RNA干扰的肌细胞P62蛋白明显增加，溶酶体弹性蛋白酶活性和棕榈酸氧化能力明显下降，脂滴增多，但辣椒素无法逆转上述变化。.本研究发现高脂环境下骨骼肌自噬流障碍，为脂质异位沉积机制提供了部分新的解释。首次明确辣椒素能通过TRPV1/Calcineurin/TFEB增强骨骼肌细胞脂自噬，拮抗高脂饮食对小鼠骨骼肌自噬和脂质代谢的损害，可为此类疾病防治提供新的干预靶点和措施。