Notch1信号通路在视网膜小胶质细胞极化及急性炎症调控中的作用和机制研究

Excessive inflammatory response is an important reason for the structure and function damage of the retina in endopthalmitis and eye trauma. As an important immune cell of the central nervous system, microglia is the ideal target cell for the regulation of inflammation and neuronal protection. Microglia polarization is sometimes categorized into classical (M1) and alternative (M2) activation. M1 microglia express proinflammatory molecules and induce inflammation， M2 microglia show the anti-inflammatory, neuroprotective effects. Regulate of the microglial phenotype polarization can give early intervention to prevent excessive inflammation and protect neurons. Notch signaling pathway plays an important role in the regulation of microglial in the innate immune. Recent study demonstrated that the Notch signaling pathway plays important role in the polarization of microglial phenotype, but the function and exact mechanisms in retina microglia polarization and acute intraocular inflammation have not been elucidated. . Current study intends to explore the specific role and mechanism of the Notch signaling pathway on microglial phenotype, inflammation-related factors and pathways in vitro and in vivo, to provide a new therapeutic strategy for the cure of the clinical acute ocular inflammatory disease.

过度的炎症反应是眼内炎和眼挫伤视网膜结构和功能损伤的重要原因。前期研究发现小胶质细胞在急性眼内炎症的启动阶段发挥重要作用，是炎症早期干预的理想靶细胞。活化的小胶质细胞呈现促炎的M1型和抗炎、神经元保护的M2型， 对M1/M2转化的调控可以达到早期干预、预防过度炎症反应和神经元保护的目的。Notch信号通路在小胶质细胞活化和天然免疫中发挥重要作用。Notch1信号通路参与了小胶质细胞表型极化的调控，但是其对视网膜小胶质细胞表型的调控和在眼内急性炎症中的作用和机制尚不清晰。本研究旨在通过体外原代视网膜小胶质细胞研究探讨Notch1信号通路在视网膜小胶质细胞极化及急性炎症早期调控中的作用和机制，利用动物模型体内验证并观察其早期炎症调控及视功能保护作用，以期发展新的治疗手段，为临床急性眼内炎症性疾病提供炎症调控及视功能保护的新的治疗策略和理论基础。

目的：研究Notch1信号通路在视网膜小胶质细胞极化调控及内毒素诱发的眼内急性炎症中的作用及作用机制.方法：体外实验用内毒素（LPS）刺激原代培养的视网膜小胶质细胞，体内实验用大鼠玻璃体腔注射LPS制作内毒素诱发的葡萄膜炎的动物模型。体内和体外实验均用γ-分泌酶抑制剂DAPT抑制Notch1信号通路。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blot分析评估Notch1信号通路的活化和抑制，以及抑制Notch1信号通路对视网膜小胶质细胞活化和极化的调控作用；同时用qRT-PCR和ELISA分析炎症因子TNF-α, IL-6和 IL-1β的表达变化以评估Notch1信号通路对视网膜小胶质细胞释放炎症因子及眼内急性炎症反应的影响。通过TUNEL分析观察视网膜神经节细胞（RGCs）的凋亡及病理组织切片观察眼内炎症细胞的浸润和视网膜神经纤维层的厚度；另外，用视网膜电流图（Electroretinogram， ERG）评估LPS注射1天和1周后视网膜的功能变化及DAPT的作用。.结果：.1. 体内和体外使用DAPT均可有效抑制LPS诱导的Notch1和Hes1在mRNA和蛋白水平的高表达；.2. 体内和体外使用LPS刺激后M1型小胶质细胞的标志物（iNOS和COX2）和M2型的标志物（Arg-1）在mRNA和蛋白水平的表达均出现明显增高。抑制Notch1信号通路后观察到LPS诱导的iNOS和COX2的高表达被部分抑制，而Arg-1的表达水平却进一步增高；.3. 体内和体外使用LPS刺激后，炎症因子TNF-α, IL-6和 IL-1β在mRNA和蛋白水平的表达均明显增高，DAPT预处理后LPS诱导的TNF-α, IL-6和 IL-1β的高表达被部分抑制；.4.DAPT预处理后LPS诱导的视网膜小胶质细胞中p-IκBα的高表达被抑制，这表明抑制Notch1信号通路后NF-κB信号通路的活化也被部分抑制；.5. 体内动物实验发现DAPT抑制Notch1信号通路后可明显减少LPS诱导的RGCs凋亡，减少眼内炎症细胞的浸润及减轻LPS导致的视网膜功能损伤。.结论：DAPT抑制Notch1信号通路可抑制视网膜小胶质细胞的M1型极化，促进M2型极化，进而减轻内毒素诱导的视网膜损伤及眼内的急性炎症反应。Notch1信号通路与NF-κB信号通路有一定的协同作用。