长爪沙鼠TLR3、TLR4基因结构与信号通路特征及其在病原易感中的机制

长爪沙鼠对病原感染极敏感，是理想的感染性疾病模型动物。Toll样受体（TLR）在机体抗感染过程中起关键作用，但长爪沙鼠TLR信号通路与其病原易感关系尚不清，我们前期工作发现长爪沙鼠的天然免疫细胞功能和获得性免疫系统活化程度均显著低于大、小鼠，据此提出假设：长爪沙鼠TLR信号通路与常用实验动物存在遗传差异，这导致其天然、获得性免疫应答均低于常用啮齿动物，从而表现出种属特异的病原易感性。我们将采用生物信息学方法分析长爪沙鼠TLRs的遗传进化特点，通过poly(I-C)、LPS体外刺激单核/巨噬细胞，采用分子生物学方法进行TLR3、TLR4及其通路的NF-κB、I型IFN等的激活水平研究，证明长爪沙鼠TLR3、TLR4信号通路特征，结合TLRs抗体预处理及病原感染试验，探索其种属特异性TLR信号通路在病原感染中作用的问题，对揭示长爪沙鼠病原易感机制有重要意义，为开发长爪沙鼠作为感染模型奠定基础。

目的（1）基本完成长爪沙鼠TLR受体测序工作；（2）探明长爪沙鼠基础免疫特性。通过与ICR小鼠进行比较研究，发现长爪沙鼠在各免疫指标上与现有常用实验动物的异同；（3）测定天然免疫细胞TLR基因序列，初步分析与其他哺乳动物（免疫学常用啮齿动物）的遗传进化关系。研究长爪沙鼠TLR3、TLR4信号传导通路关键因子的激活水平及时效关系，证实长爪沙鼠TLR3和TLR4受体信号通路特异性性状（如未激活或迟缓等）。方法（1）以免疫学常用啮齿类实验动物（ICR小鼠）为研究对照初步比较长爪沙鼠与ICR小鼠的免疫差异；（2）利用illumina的Hiseq2000高通量测序平台对构建的脾细胞RNA样本进行测序，得到TLR基因序列。分别对TLR3和TLR4进行系统进化树分析和氨基酸序列、蛋白结构的预测。以测得的基因序列分别设计TLR3和TLR4基因的引物。选取poly(I:C)和LPS两种配体稀释成不同浓度的工作溶液（终浓度poly(I:C)：1.25、5、10和20μg/ml；LPS：5、10、20和25μg/ml），诱导长爪沙鼠和ICR小鼠的TLR3、TLR4受体通路激活，以real-time PCR测定基因表达。结果 经测序得到TLR的mRNA序列，分析TLR3/4基因的mRNA序列与大小鼠和中国田鼠相似度最高。构建进化树表明，长爪沙鼠与大小鼠和中国田鼠的同源性最高。比较小鼠和长爪沙鼠TLR3/4氨基酸序列和蛋白结构可知长爪沙鼠与小鼠存在很多差异。Real-time PCR测定TLR3/4信号通路激活TLR3/4基因的表达，以ICR小鼠为对照，在各浓度Poly(I:C)和LPS配体的刺激下，长爪沙鼠的TLR3、TLR4基因的表达量没有随着刺激浓度的增高而增加，而小鼠在各浓度刺激下均有显著的增加（P<0.05）。结论（1）长爪沙鼠基础免疫功能显著性低于ICR小鼠，提示长爪沙鼠在细胞层面上免疫能力低于ICR小鼠；（2）在长爪沙鼠TLR3、TLR4信号传导通路关键因子的激活水平上，证实长爪沙鼠TLR3和TLR4受体信号激活迟缓或未被激活，这些特性可能是长爪沙鼠病原易感性的部分原因。