新型DiLeu标记定量方法及其在解析肿瘤转移关键因子PKCζ相关动态分子网络中的应用研究

Tumor metastasis is the major death cause in cancer patients, and currently there's no efficient medication to control such process. Chemotaxis, the directional movement of cell in response to a chemical gradient, plays an important role in tumor metastasis. In our previous study, we discovered protein kinase C ζ (PKCζ) mediates chemotaxis by regulating cytoskeleton rearrangement and cell adhesion through the PDK1/AKT2/PKCζ pathway. Our ongoing research suggests PKCζ plays such role by interacting with many other signaling molecules; however their identities remain unknown. In this study we will use novel DiLeu isobaric labeling quantification method and biphasic HPLC separation to establish an efficient analysis system to investigate the dynamic change of the signaling molecular network involved with cancer cell chemotaxis using PKCζ as bait. And their functions will be further studied using cell chemtaxis assay. This study will reveal the molecular mechanism regulating tumor cell chemotaxis, and provide theoretical basis for developing novel medication to control tumor metastasis.

肿瘤转移是导致癌症患者死亡的主要原因，而目前国际上尚无有效的治疗方法。趋化运动在癌转移中起着关键的作用。我们的研究显示表皮生长因子（EGF）通过活化PDK1/AKT2/PKCζ通路来诱导肿瘤细胞的趋化运动。其中PKCζ是一个关键性的信号分子。但目前肿瘤细胞趋化运动过程中调控PKCζ激活及其激活下游通路的详细机制并不清楚。在本项目中我们将结合新型的DiLeu稳定同位素定量标记法与二维一体纳流高效液相色谱在线分离技术建立研究细胞内信号传导通路动态变化的新型质谱分析方法。并以此为基础系统性地研究PKCζ相互作用蛋白分子在趋化运动中的动态表达，以确立调控趋化运动的信号分子网络模型。同时，我们将采用已建立的趋化运动实验方法从细胞生物学的角度对寻找到的新型蛋白进行功能确认。该项目研究将进一步揭示肿瘤细胞趋化运动的信号传导分子机制，并为筛选新型药物靶点与发展治疗癌症转移的特效药物提供重要依据。

肿瘤转移是导致癌症患者死亡的主要原因，而肿瘤细胞的趋化运动在癌转移过程中起着关键的作用。我们在前期研究中发现表皮生长因子（EGF）通过活化PDK1/AKT2/PKCζ信号通路来诱导癌细胞的趋化运动。其中PKCζ是一个关键性的信号分子。但目前在肿瘤细胞趋化运动过程中调控PKCζ激活以及它如何激活下游通路的详细机制并不清楚。在本项目中我们首先针对PKCζ在趋化运动通路中的功能进行了深入探索。完善了通过免疫共沉淀获取目标分子相互作用蛋白的实验方法，结合定量质谱分析鉴定了PKCζ的相互作用蛋白质组，并且通过非标记定量蛋白质组学的方法对其相互作用蛋白在EGF调控的趋化运动中所发生的变化进行了研究。实验结果揭示了多个未报导过的PKCζ相互作用蛋白质，如cofilin, ELMO2, VASP等。这些蛋白主要集中在调控细胞骨架和细胞粘附的信号通路当中，在调控细胞运动方面起到重要作用。同时，在以上的研究中我们发现C1QBP是一个新型的PKCζ的相互作用蛋白，这提示我们C1QBP很可能通过PKCζ影响肿瘤的趋化运动。C1QBP是一个多功能的蛋白分子，它与机体免疫、细胞凋亡等多种生理过程相关。为了进了解C1QBP的生物学功能，我们通过高速离心等方法进一步完善了相互作用蛋白纯化的样品处理方法，通过准确的同位素标记结合质谱分析的方法对其相互作用蛋白进行了分析，并确认了它和PKCζ的相互作用关系。实验显示C1QBP的氮端与PKCζ的激酶调控结构域之间存在相互作用，并且该相互作用影响PKCζ的磷酸化以及它向细胞膜的转位。这些观察结果证明C1QBP在PKCζ的信号通路上游，而且对其活性有明显的影响。细胞学实验则表明C1QBP通过PKCζ调控细胞骨架重组和细胞在运动中的极性。动物实验和临床样本分析进一步确认了C1QBP是一个重要的乳腺癌转移的调控因子，降低其表达水平可以很大程度上抑制乳腺癌的肺转移。综上所述，我们建立和优化了相互作用蛋白组的生物质谱分析方法，获得了大量传统生物学无法得到的蛋白相互作用信息，通过结合分子生物学和细胞生物学的实验手段对我们获得的质谱数据进行了充分的验证，并发现了一个新型的肿瘤转移调控因子，进一步揭示了以PKCζ为核心的趋化运动分子机制，为深入解析肿瘤转移的分子调控过程、寻找抑制肿瘤转移的新型药物靶点提供了重要理论基础。