棉花高温胁迫下花药败育分子调控机理研究

Research on the molecular mechanism of anther abortion under high temperature (HT), exploring HT tolerant genes to creat new high temperature tolerant cotton germplsm, play important roles in stabilizing cotton production under global climate warming conditions. In our previous study, a casein kinase I gene were isolated and identified during cotton anther development under HT, defined as GhCKI. Overexpression of GhCKI in HT-sensitive cotton and Arabidopsis caused anther abortion, similar to the phenotype of HT-sensitive cotton exposed to HT. Thus, we propose that GhCKI may be a key regulator of cotton anther abortion regulation network under HT stress. In the present project, to investigate the possible metabolic pathways and the possible target genes of GhCKI in cotton anthers under HT, we will compare the physiological and biochemical index, transcriptome, proteome, phosphorylated proteome between HT-tolerant and HT-sensitive cotton anthers under normal conditions and HT conditions, to further decide the pathways responsive to HT stress. Furthermore, the interaction proteins or direct downstream genes of GhCKI will be indentified by Yeast two Hybrid and Bimolecular fluorescence complementation. Moreover, the upstream regulation network will be investigated by Yeast one Hybrid and LUC report system, base on the HT induced expression pattern changes of progressive deletions of the GhCKI promoter. Then the biological function and the regulation pathways of GhCKI during HT tolerance in cotton anthers will be further illuminated. This study will provide candidate gene and theoretical basis for HT resistant breeding programs and new male sterility germplasm development in cotton.

研究高温胁迫下花药败育机理、发掘提高花药耐高温能力的基因资源并用于耐高温新材料创制对于全球气候变暖大环境下稳定我国未来棉花生产具有十分重要的意义。本课题组前期从棉花花药高温胁迫表达谱中分离到一个I型酪蛋白激酶GhCKI，在棉花和拟南芥中超量表达该基因会产生与高温敏感材料受高温胁迫后相类似的表型-花药败育，由此推测GhCKI是高温胁迫导致花药败育调控网络中的关键因子。本项目拟在比较高温胁迫下耐受和敏感材料花药的转录组、蛋白组及磷酸化蛋白组，并与GhCKI超表达拟南芥相结合，筛选影响花药高温耐受性的代谢路径及GhCKI的靶标基因；进一步通过酵母双杂交和BiFC等确定GhCKI的互作蛋白或直接下游基因；利用其启动子高温诱导的表达模式及酵母单杂系统分析其上游的调控机制，从而明确GhCKI在调控棉花高温响应过程中的生物学功能和调控途径，为耐高温和新不育棉花材料创制提供候选基因及理论依据。

高温导致雄性败育是作物减产的主要原因。前期通过转录组及转基因分析发现GhCKI可能为植物花药发育的关键信号因子，同时在高温胁迫导致的棉花花药败育中具有重要作用。GhCKI是I型的酪蛋白激酶，故本项目一方面通过对耐敏材料高温处理前后的花药磷酸化蛋白质组进行分析，获得1016个在耐敏材料之间存在差异的磷酸化肽段，对这些差异磷酸化肽段进行motif分析后发现，有38个Ser和3个Thr磷酸化的motif。有意思的是，所有的motif都可以被CKI磷酸化。说明CKI在高温胁迫导致棉花花药败育过程中起重要作用。进一步对过表达GhCKI的拟南芥花蕾进行了磷酸化蛋白质组分析，获得1093差异的磷酸化肽段，对其参与的路径进行富集分析，发现GhCKI的过表达导致花药败育除了影响了糖代谢路径外，还引起了脂代谢的异常。结合两组磷酸化蛋白质组的结果获得30个unique的共有蛋白，其中有一个蛋白是参与脂代谢的，命名为GhCKIP1。通过在棉花中过表达此基因，出现常温下雄性败育表型。另一方面，高温胁迫下，在耐敏高温棉花材料中表达变化明显的GhCKI基因其启动子序列没有差别。因此对其上游响应高温的核心启动子区进行了挖掘，发现-169-(-478)区是GhCKI响应高温并在花药中提前表达的重要区域。通过酵母单杂交实验，筛选得到一个GhLEC1和两个GhMYB转录因子可以作用于此区段。GhLEC1负调控GhCKI，GhLEC1与GhCKI协同影响高温胁迫下花药败育还在深入的分析中。两个GhMYB转录因子影响GhCKI的表达及与雄性不育之间的关系已经获得大量的数据，我们将在后续的研究中揭示这部分的结果。综上所述，我们以GhCKI为切入点比较高温耐敏棉花材料‘84021’和‘H05’高温处理前后的花药蛋白表达谱及蛋白磷酸化修饰特征，并结合超量表达GhCKI的拟南芥花蕾与野生型拟南芥花蕾的蛋白表达谱及蛋白磷酸化修饰的比较，筛选GhCKI的调控靶标，同时分析GhCKI基因在高温胁迫下的上游调控网络，为棉花耐高温材料筛选和育种以及棉花不育系材料创制提供新方法和新思路。