miR-27b介导Pax3基因调控山羊骨骼肌细胞增殖与分化研究

Muscle growth and development were due to an increase in the number of muscle fibers and cell volume expansion which dependent on the proliferation and differentiation of muscle cells. However, the regulation mechanisms, especially in post-transcriptional level, were unclear. The discovery of microRNAs provided a new direction on the study. Our previous studies found significant differences in expression of miR-27b in skeletal muscle of goats at different developmental stages. Combined with other research, we proposed that miR-27b regulated the skeletal muscle cell proliferation and differentiation through Pax3 gene. To further investigate the regulation mechnism, we will analyze the expression pattern of miR-27b and Pax3 in both muscle samples and skeletal muscle cells of Huanghuai Goat. Using the dual luciferase activity assays, Realtime Q-PCR, Western blot and confocal microscopy observation, we will study the molecular mechanisms of goat skeletal muscle cell proliferation and differentiation modified by miR-27b regulation of Pax3 expression. The study is expected to have some breakthrough discovery about directional differentiation mechanism of the skeletal muscle cells. The results will provide new avenues of exploration for further reveal gene regulation in the skeletal muscle growth and development related to studies.

肌肉生长发育表现为肌纤维数目增加和细胞体积膨胀，这两个方面依赖于肌肉细胞的增殖和分化。而调控肌肉细胞增殖与分化分子机制，尤其是转录后调节机制尚不明确。microRNAs的发现为此研究提出新的方向。本组前期研究发现在山羊不同发育阶段骨骼肌中miR-27b显著差异表达，结合最新资料推测miR-27b通过作用Pax3基因调控骨骼肌细胞的增殖与分化。本项目拟以前期筛选的miR-27b为基础，以生长较慢的黄淮山羊和生长快的波尔山羊为材料，分析miR-27b及其预测靶基因Pax3在山羊骨骼肌及其细胞中的表达规律；进而通过双荧光素酶活性实验、qPCR、Western blot等方法研究miR-27b靶向作用Pax3基因调控山羊骨骼肌细胞增殖与分化作用及机制。该项研究在理论上可望在肌肉细胞定向分化分子机制等方面取得突破性发现，为进一步揭示骨骼肌生长发育相关基因调控研究提供新的探索途径和理论基础。

项目背景: 山羊肌肉的生长发育是一个十分复杂的过程,受到很多转录因子的调控。近年来研究表明miRNAs 可以通过调控转录因子调节肌肉形成过程中细胞增殖、分化，与肌肉发育和疾病发生密切相关。miR-27b在小鼠等模式动物上相关研究表明，其为重要的肌肉调控因子，推测其在山羊肌肉生长发育存在重要的调控作用。因此本论文通过研究miR-27b在山羊肌肉增殖与分化调控方面的影响，为山羊育种提供理论依据.研究内容: 本项目以生长发育较慢的安淮山羊（源于黄淮山羊）和生长发育较快的波尔山羊为研究对象，分离、鉴定山羊骨骼肌中miR-27b，并分析其在两种山羊骨骼肌及其细胞中的表达规律；同时克隆获得目标靶基因Pax3 全序列；进而通过双荧光素酶报告基因实验、Real-time PCR、Western blot 和共聚焦显微镜观察等方法研究miR-27b 介导Pax3 基因调控山羊骨骼肌细胞增殖与分化的作用机制。.重要结果: ①研究发现miR-27b随着山羊骨骼肌卫星细胞增殖，其表达量逐渐下降，而Pax3表达量则逐渐上升；而miR-27b在山羊骨骼肌卫星细胞分化过程中，其表达量逐渐上升，而Pax3的表达量则逐渐下降。②转染miR-27b mimics能够显著降低野生型载体的荧光值，而突变型载体的荧光值相对于阴性对照组没有明显变化，证明了Pax3基因3’UTR上有miR-27b的结合位点，从而表明Pax3基因是miR-27b的靶基因。③分析转染 Pri-miR-27b 或miR-27b inhibitor 及正常表达（对照）三种处理情况下的骨骼肌细胞中Pax3 基因下游增殖与分化特异性相关基因的mRNA 表达水平，同时观察转染后细胞增殖与分化形态变化。结果发现转染miR-27b mimics组中miR-27b的表达量显著地高于其他组。转染了miR-27b inhibitor实验组的EdU阳性率的细胞数显著高于对照组，而miR-27b mimics组的EdU阳性率细胞数则显著降低。从这结果可以看出miR-27b能够抑制山羊骨骼肌卫星细胞的增殖。.科学意义: 本研究揭示了miR-27b对骨骼肌卫星细胞增殖与分化的影响，为进一步研究miRNA在骨骼肌生长发育中的作用提供一定的理论依据，进一步完善山羊肌肉生长发育过程中的调控网络，也为其他miRNA在肌肉调控方面的研究提供了研究思路。