儿茶素调控山羊骨骼肌细胞抗氧化活性及机理研究

With more atttention being paid to meat quality by consumers, how to reduce meat quality reduction caused by oxidative stress has become a key research point. .Previous studies showed that exogenous tea catechins supplementation induced expression of endogenous antioxidant enzymes in vivo, and the potential mechanisms through activating Nrf2-ARE signaling by tea catechins have been vertified in many cell models in vitro..Although we have studied the effects of tea catechins on regulation of antioxidant enzyme activity of skeletal muscle tissue in goats in vivo and in vitro, further studies are still needed to investigate the exact molecular mechanisms..The objective of this grant is to study the mechanisms of regulating antioxidant activity of skeletal muscle cells in goats by tea catechins supplementation through investigating potential molecular pathways of activating Nrf2-ARE signaling and dose-dependent manners.The main research methods will include coloning proteins related to Nrf2-ARE signaling，modelling antioxidative stress model in skeletal muscle cell of goats and using RNA interference, real-time PCR, Western blot and immunoprecipitate. This grant will provide further evidence to improve ruminant meat quality by utilizing plant polyphenols.

随着人们对肉品质的关注，如何控制氧化应激引起的肉品质下降已成为畜产品质量研究的重点。已有的研究表明，在机体水平，外源儿茶素能够诱导动物体内源抗氧化酶的表达,提高肌肉组织抗氧化活性；在细胞水平，儿茶素通过激活Nrf2-ARE信号通路诱导抗氧化酶表达的分子机制在许多细胞模型中已得到证实。申请者已对儿茶素在山羊体内外调控骨骼肌组织抗氧化能力进行了前期探索，但其确切分子机理尚需深入研究。本项目拟通过克隆山羊骨骼肌细胞中与调控Nrf2-ARE信号通路有关的蛋白，建立山羊骨骼肌细胞抗氧化应激模型，应用RNA干扰、实时荧光定量PCR、Western blot和免疫沉淀技术研究Nrf2和Keap1的基因功能，探讨儿茶素激活Nrf2-ARE信号通路的可能途径及其诱导抗氧化酶表达的浓度依赖效应，最终阐明儿茶素调控山羊骨骼肌细胞抗氧化活性的分子机理，为广泛应用植物多酚类抗氧化剂提高反刍动物肉品质提供科学依据。

肉类食品是人体所需优质蛋白质和脂肪酸的主要来源，随着生活水平的提高，人们对肉品质有了更高的要求，肉制品的营养价值、颜色、嫩度、风味和货架期是指征其品质高低的主要指标。动物育肥期和屠宰后的肉制品加工和贮藏过程中产生的氧化应激被认为是导致肉制品颜色加深、嫩度下降、货架期缩短和营养价值降低的主要因素之一，而提高肌肉抗氧化性能够抑制肉制品中脂质过氧化反应和蛋白氧化，提高多不饱和脂肪酸含量，降低滴水损失，提高肉色稳定性，延长货架期。因此，提高肉制品抗氧化活性无疑是提高肉品质的重要途径，而应用外源抗氧化剂是提高动物体抗氧化性的重要途径。本研究通过筛选调控抗氧化酶表达的主要调控蛋白，克隆未知基因序列，并分析基因功能，进而通过细胞培养试验，探讨主要调控因子在Nrf2-ARE信号通路中的调控作用，进而利用骨骼肌细胞氧化应激模型，明确了儿茶素与抗氧化酶诱导剂1,3-二硫酸-2-硫因（D3T）相比对抗氧化酶表达的调控作用，最终在细胞水平上揭示了儿茶素调控山羊骨骼肌抗氧化性的分子机理，主要结果如下：首先，克隆得到了山羊骨骼肌kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1)基因部分mRNA序列971bp，含有启动子和部分开放阅读框架，并已经在Genbank上注册，注册号为KF038327.1，BLAST比对结果显示，克隆得到的目的基因序列和Genbank中已注册的预测山羊Keap1基因全部cds、牛的Keap1基因部分cds序列相似度为100％。然后，利用RNAi技术，在细胞和分子水平上证实Keap1基因沉默后能够上调抗氧化酶表达，并且这种调控作用对于应激状态下的细胞效果更加显著，说明Keap1是调控Nrf2-ARE信号通路的主要蛋白；最后，体内外试验一致表明，与D3T相似，儿茶素通过抑制Keap1蛋白表达影响细胞抗氧化酶活性，而已知研究显示D3T的抗氧化机制是通过激活Nrf2-Keap1信号通路而启动抗氧化酶表达。所以，本试验推论：儿茶素也可能是通过抑制Keap1表达进而激活Nrf2-ARE信号通路而提高山羊骨骼肌细胞抗氧化活性。综上所述，本项目研究在分子水平上明确了儿茶素提高机体抗氧化性的机理，并验证了儿茶素调控山羊骨骼肌细胞抗氧化酶表达信号通路中的调控蛋白和及其功能，具有一定理论创新性。