栉孔扇贝Klf4基因在性别形成中的调控机制研究

Shellfish aquaculture is one of the most important mariculture industry in China. Understanding the sex development mechanism will greatly contribute to the artificial sex regulation and shellfish breeding efficiency. Our preliminary results revealed the Klf4 gene specifically expressed in the testis of Zhikong scallop, Chlamys farreri, and development of the testis is blocked and even sexual reversed after the interfering of the Klf4 gene using RNAi. This project plans to screen differentially expressed genes from the testis samples between RNAi treated and control groups of Zhikong scallop using the RNA-seq technology; construct the testis genes co-expression network using WGCNA; obtain the Klf4 gene regulatory network and analyze the expression pattern of the key genes in the network during testis formation. Furthermore, we attempt to mutate the Klf4 gene in the testis of juvenile and adult scallop with the targeted gene mutation technology CRISPR/Cas9, in order to verify its function during the testis formation. All these work will help to initially elucidate the regulation mechanism of Klf4 gene in the testis formation, and provide academic data for the development and application of reproductive regulation technologies in shellfish aquaculture.

贝类养殖是我国海水养殖的支柱产业之一，解析贝类性别形成机制将有助于人工控制性别和加速育种效率。课题组前期研究发现栉孔扇贝Klf4基因在精巢中特异表达，并在RNAi敲降后引起精巢发育阻滞、甚至性逆转。本项目拟采用基因表达谱分析技术，筛选Klf4基因敲降组和对照组栉孔扇贝精巢的差异表达基因；使用WGCNA技术，构建精巢的基因共表达网络，确定Klf4基因调控网络并分析该网络中关键基因在精巢形成中的表达模式；尝试使用CRISPR/Cas9技术，定点敲除稚贝和成贝性腺中的Klf4基因，验证该基因在精巢形成中的功能，初步解析Klf4在性别形成中的遗传调控机制，为贝类生殖调控的发展和应用奠定理论基础。

两性动物性别决定和分化调控机制的研究一直是动物繁育领域的研究热点之一，至今有关贝类性别形成的分子机制尚不清楚，限制了人工性别控制等生殖调控技术在贝类育种中的应用。本项目以我国重要的海水养殖贝类栉孔扇贝为研究对象，对Klf4基因参与其精巢发育和功能维持的调控机制进行了初步解析。项目研究发现，Klf4 mRNA及KLF4蛋白在栉孔扇贝性腺中呈二态型表达特征，特异地表达于精巢大部分生殖细胞中。通过RNAi技术对Klf4 mRNA进行敲降，发现精巢发育和精子发生明显受阻，性腺指数降低、雄配子数量减少且精母细胞大量凋亡，并且出现雄转雌的性逆转现象。对Klf4 mRNA敲降3天、10天和24天的精巢样品进行转录组分析，发现差异表达基因主要涉及细胞增殖（c-Myc、fscn1、cd109、irf2 etc.）、细胞凋亡（Traf3、orct、stk3、plk1 etc.）和精子发生（ccdc63、txip1、aka14、tssk3、spag6 etc.）等过程，通过WGCNA分析将栉孔扇贝精巢中表达的基因构建为25个模块。研究成果表明Klf4基因在栉孔扇贝精巢功能维持和精子发生中发挥重要的作用，其对精巢的调控主要是作为转录因子调控其下游生精细胞、细胞增殖和细胞凋亡的相关基因和通路，进而调控雄性生殖细胞的发生和凋亡。本项目成果为贝类性别发育分子机制的深入探讨，以及相关贝类生殖调控技术的发展和应用提供了科学依据。