7种活血化瘀中药抑制凝血因子Xa的活性成分及作用机理研究

Thrombotic disease seriously harm human health, but the traditional anticoagulants have many defects. The development of a new generation of anticoagulants has become a research focus all over the world. It seems that factor Xa activity can be markedly suppressed without affecting haemostasis, so FXa has emerged as an attractive target for new anticoagulants. Discovery of new structure types of active compounds inhibiting FXa for a new generation of anticoagulant drug research is crucial. The aims details are as follows: At first, the active compounds of direct inhibition of FXa will be purified and identified from the 7 kinds of Chinese herbs for promoting blood circulation and removing blood stasis by preparing HPLC binding active tracking method. secondly, The active compounds isolated are evaluated for inhibitory potency against human FXa in vitro, activity in the prolongation of prothrombin time (PT), selectivity to FXa， anticoagulant effect in vivo, and bleeding time etc. These will get valuable lead compounds with small molecular weight, direct inhibition of FXa inhibitors. Thirdly, to investigate the inhibitory mechanism of the lead compounds by studying inhibition kinetics to FXa and X-ray diffraction of complex crystal with FXa will provide a scientific basis for novel anticoagulant drugs with independent intellectual property rights and lay the material foundation.

血栓性疾病严重危害人类健康，而传统抗凝药又存在许多局限。新一代抗凝药的研发成为全球抗凝药研究的热点。现代研究表明显著抑制活化的凝血因子Xa(FXa)可有效抗凝而不影响基本的止血，这使FXa抑制剂成为理想的抗凝药物。抑制FXa的新结构类型活性化合物的发现对新一代抗凝药的研究至关重要。本项目主要研究:①从课题组筛选出的7种抑制FXa的活血化瘀草药中，运用制备HPLC结合活性示踪的方法分离直接抑制FXa的小分子活性成分并鉴定其结构；②对发现的活性成分进行包括体外抑制FXa的活力、体外对凝血酶原时间的延长作用、对FXa抑制的专一性、体内抗凝血作用和体内对出血时间的影响等活性综合评价，优选出具有进一步研究价值的直接抑制FXa的小分子的先导化合物；③通过先导化合物对FXa的抑制动力学和与FXa形成的复合物晶体的X-衍射研究探讨其抑制机制。为研发具有自主知识产权的新颖抗凝药物提供科学依据，奠定物质基础。

血栓性疾病严重危害人类健康，是人类发病率和死亡率最高的疾病之一。传统抗凝药治疗窗狭窄，起效和失效缓慢，非胃肠道给药，容易导致出血等缺陷，致使新一代抗凝药的研发成为全球抗凝药研究的热点。现代研究表明显著抑制活化的凝血因子Xa(FXa)可有效抗凝而不影响基本的止血，这使FXa抑制剂成为理想的抗凝药物。本项目对活血化瘀中药的筛选时发现丹参、牛膝、泽兰、王不留行、郁金、桃仁、刘寄奴等7种中药提取物具有较高的抑制FXa活性。利用各种色谱技术从7种中药直接抑制FXa的活性部位进行了化学成分的分离纯化，并借助光谱、波谱和质谱等手段鉴定了化合物结构。总共分得67个化合物，其中8个化合物为新化合物。对分离化合物抑制FXa活性测定发现齐墩果酸-3-O-β-D-（6'-甲酯）-吡喃葡萄糖醛酸苷、齐墩果酸3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷、artanoside A、白桦脂酸等化合物抑制FXa的IC50<100μM，具有较强的抗凝活性。在对五环三萜的筛查中发现甘草次酸也具有很强的抑制FXa的活性，IC50为32.6μM。酶学动力学研究证明齐墩果酸-3-O-β-D-（6'-甲酯）-吡喃葡萄糖醛酸苷为FXa的竞争性抑制剂，甘草次酸为反竞争性抑制剂。对专一性研究证明齐墩果酸-3-O-β-D-（6'-甲酯）-吡喃葡萄糖醛酸苷对FXa的专一性最强，甘草次酸也具有较强的专一性；白桦脂酸专一性较差，对其他丝氨酸蛋白酶均有一定的抑制作用。体内实验证明白桦脂酸和甘草次酸在25mg/kg灌胃给药对静脉血栓都有显著的抗凝效果而不会引起明显的出血后果。研究还发现甘草次酸和川芎嗪还具有协同抗凝和抗血栓作用，有一定的开发价值。从酶学动力学和分子对接结果显示天然的小分子化合物不是结合于FXa的活性中心，可能在FXa的活性中心之外还存在一个别构调节中心，这些化合物是结合在别构调节中心而抑制了FXa的活性。通过以上研究从活血化瘀植物性中药中分离鉴定直接抑制FXa的小分子活性成分，其中五环三萜类成分活性最强。体内外抗凝活性、出血风险等方面评估确定白桦脂酸和甘草次酸是具有抗凝前景的先导化合物。为进一步开发与FXa有高亲和力和良好口服生物利用度的新抗凝药物奠定科学基础。