构建具有生物活性的蛋白酶超分子聚合物

以结构复杂且易失活的蛋白酶作为构筑模块，设计制备自主创新的活性蛋白酶组装体极富挑战性。本课题拟以谷胱甘肽硫转移酶(GST)为构筑模块，在兼顾GST固有的高效生物活性的基础上，探索在温和条件下能有效组装蛋白酶形成超分子聚合物的选择性修饰方法。即运用蛋白质模拟技术构建可靠的GST模型，通过对GST模型表面的氨基酸构象进行分析，精确锁定GST表面最佳的修饰位点。将带有目的基团的短链或甲硫氨酸类似物通过化学或分子生物学方法引入GST表面的拟修饰位点，利用引入的目的基团之间成键，并结合超分子技术即可实现GST聚合物的自组装。进一步以GST聚合物组装体为基础，紧密结合光谱学、结构学、化学和酶学等多学科交叉，对GST聚合物组装体的结构、形貌以及生物活性进行表征分析。本研究可解决活性蛋白酶在体外难以组装的问题，为制备出结构更为复杂的活性蛋白酶组装体提供新的思路和借鉴。

蛋白是生命的物质基础，研究其自聚集现象，将有利于揭示生物分子如何从微观向宏观演变发展的规律，推动生物医学材料的发展。本项目以结构复杂且易失活的谷胱甘肽硫转移酶（GST）作为构筑基元，通过温和的蛋白表面定点修饰技术，引入外源功能基团。利用基团间可逆的、方向性的非共价作用力诱导蛋白彼此间识别、聚集，制备具有生物酶学活性的蛋白酶超分子聚合物。所有的研究工作均按照原有申请计划进行，进展较为顺利，并取得了预期实验结果。主要研究成果如下：.1.运用基因工程技术，在GST的N末端修饰一段由6个组氨酸残基（His）组成的肽链。通过His与金属镍离子间的螯合作用，结合GST二聚体自身C2对称的结构特点，成功诱导GST自组装形成链状超分子聚合物。进一步利用EDTA分子，竞争性螯合镍离子，破坏蛋白间非共价金属配位作用，使GST超分子聚合物发生解聚，实现其聚合与解聚过程的可逆调控。所得GST超分子聚合物经生物酶学表征，结果表明该聚合行为可略微提高蛋白酶的生物活性，实现蛋白酶分子间彼此协同催化，提升了其潜在的应用价值。.2.依据计算机模拟结果，运用基因突变技术，在GST特定识别界面设计修饰一个组氨酸残基（Cys137→His137）。通过GST二聚体彼此间突变的His137和相邻的His138与金属镍离子的螯合作用，并利用蛋白-蛋白识别界面间多重非共价作用力辅助，使蛋白自聚集方向发生改变，形成首尾相连的环状GST超分子聚集体。该研究成果揭示蛋白自聚集的一般规律，即由蛋白彼此间首要识别因素与蛋白界面间多重弱相互作用协同驱动的自下而上的自组装过程。进一步通过调节溶液中盐离子浓度，屏蔽蛋白界面间静电作用网络，调控蛋白-蛋白识别的非共价相互作用力，成功获得尺寸大小不同的环状GST超分子聚合物，使蛋白自聚集朝着完全可控的方向又迈出重要一步。.3.受前期工作1的启发，运用基因工程技术，在GST的N末端修饰一段由苯丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸（FGG）组成的肽链。利用FGG与葫芦尿8（CB8）间的主客体相互作用，成功诱导GST形成超分子聚合物。进一步通过人工仿酶技术，在GST单体中设计构筑硒酶催化中心，获得高效稳定的抗氧化剂，实现了蛋白超分子聚合物的功能化与应用。