软枣猕猴桃红肉性状形成关键基因挖掘与功能分析

Flesh color is an important commercial trait for kiwifruits (Actinidia Lindl.). Breeding large fruit cultivar with whole-red color is one of the important targets of kiwifruit breeding. Anthocyanins are the main pigments in the red flesh kiwifruit, but the current study of kiwifruit anthocyanin metabolism is mainly confined to the varieties with red core. Whole red kiwifruits are rich in anthocyanins, and they have important value for market, nutrition and research, but the molecular mechanism(s) of anthocyanin synthesis and metabolism in this type of kiwifruit is unclear. In this study, by using the whole red type A.arguta as the research material, the techniques of high performance liquid chromatography and mass spectrum(HPLC-MS), transcriptome sequencing and Proteome were involved to investigate the anthocyanin composition and content during the fruit development, and to identify. the genes with different expression level which will be verified by qRT-PCR. The expression model of special proteins with different expression level in spatial and timing will be studied by west blotting method. The results of comprehensive analysis will be used to ascertain the molecular basis of red flesh character formation of the whole red type kiwifruit and identification of the key candidate gene(s). The gene function will be verified by transgene technology.The results will provide the theoretical and genetic resources for kiwifruit color trait breeding.

果肉色泽是猕猴桃重要的品质特征，培育果个较大的全红型新品种已成为了猕猴桃育种的重要方向之一。花青素是红肉猕猴桃的主要色素，但目前针对猕猴桃花青素代谢的研究主要限于红心类型的品种。全红型软枣猕猴桃富含花青素，具有重要的经济、营养和研究价值，但其合成代谢的分子机制尚不清楚。本研究主要采用全红型软枣猕猴桃为试材，综合利用液相色谱-质谱、转录组和蛋白质组等技术，测定其不同生长发育时期花青素苷种类及含量特征；根据转录水平的差异，获得差异表达基因，并用qRT-PCR技术验证差异基因表达；同时利用Western blotting验证差异表达蛋白时空表达特性。通过综合分析，获得全红型软枣猕猴桃果实色泽形成的重要候选基因，分析基因特性，最后通过转基因的方法进行基因功能验证，明确控制果肉红色性状形成的关键基因，为猕猴桃色泽性状的遗传改良提供基因资源和理论依据。

“好看、好吃、健康”的新品种培育是猕猴桃育种重要目标和方向，发掘色泽艳丽的品种资源、理解果实色泽性状形成的分子基础具有重要理论意义和实际应用价值。猕猴桃属(Actinidia Lindl.)植物花青素代谢研究主要限于红心类型品种，加强对全红型软枣猕猴桃果实色泽发育机制研究，寻找与果实色泽发育相关的关键基因，为今后猕猴桃育种遗传改良奠定基础。.1、花青素苷含量的测定.以红肉软枣猕猴桃‘天源红’和同种绿肉猕猴桃‘永丰一号’为试材，测定盛花后8个时期果肉样品色差指标值a、b；用高效液相色谱法对同期花色苷含量进行半定量分析。同时对‘天源红’进行套袋处理，定期检测相同指标。.2、转录组研究.选择两个品种三个关键期（70d、100d和120d）进行转录组测序，系统分析和比较转录组差异表达谱，并进行基因注释和功能分类，筛查特异表达基因；通过qRT-PCR验证转录组测序质量，并结合其他物种同源基因，筛选确定红肉性状形成的关键候选结构基因。.3、蛋白组研究.采用iTRAQ技术，分析比较两品种70d和100d样品中蛋白质谱；挑选12对不同功能的差异蛋白进行q-PCR验证。.4、果实红色性状重要候选基因的功能验证.超量表达候选关键基因转化番茄，获得转基因株系，通过性状表现完成关键基因的功能验证。.通过项目实施：（1）‘天源红’盛花后90d初次检测到花色苷，盛花后120d达到最大。（2）鉴定了无色花青素双氧酶（LDOX）是其花色苷合成过程中起关键作用的结构基因；绘制了‘天源红’花色苷生物合成路径图；套袋处理可抑制LDOX在果实外果皮、果肉中的表达，同时抑制类黄酮-3-O-半乳糖基转移酶（F3GT）在果肉中的表达，因此影响果实着色。（3）在不同果肉颜色品种中光合作用能量代谢、碳代谢以及氮代谢相关的蛋白质有较大差异，花青素合成途径相关苯丙氨酸解氨酶(PAL）等也有差异。（4）从‘天源红’中克隆出LDOX基因，以‘绿宝石’番茄为转基因材料，正在开展转基因功能验证。 已正式发表研究论文4篇，其中SCI论文1篇（IE4.259），另有1篇SCI论文GENE已接受（IE2.42）。培养硕士研究生2名。