基于转录组学挖掘调控羊踯躅花瓣黄色性状形成的关键基因

Rhododendron molle is also known as the Yellow azalea, which is a rare species blooming with yellow flowers and is the precious germplasm resource for breeding new Rhododendron varieties with yellow flowers. Hence, identifying the key genes involved in the yellow flowers formation and studying their regulatory mechanisms at the molecular level have great important theoretical and practical significance. In this study we collected flower petals of different developmental stages in Rhododendron molle and its mutant as material. Their transcriptome will be sequenced by the latest technology. The candidate genes which regulate the formation of flower color will be selected using the latest transcriptome and molecular biological technologies. The full-length sequence of key genes will be isolated by 5’, 3’ RACE method. The transcriptional patterns of key genes will be studied at different organs of different development stages in different Rhododendron varieties by qRT-PCR and RNA in situ hybridization. Transgenic technology will be further used for the analysis of their function. The research will identify the key genes involved in yellow flower pigmentation and clarify the mechanism of flower color formation in Rhododendron molle, and provide possibility for yellow flower directional breeding in Rhododendron.

羊踯躅又名黄杜鹃，是杜鹃属植物中极少数开金黄色花的物种，是培育黄色杜鹃新品种的珍稀种质资源，挖掘其花色形成的关键因子具有重要的理论和现实意义。本研究以羊踯躅野生型及其突变体为材料，基于最新的转录组学分析技术，采用分子生物学手段对羊踯躅野生型花朵不同发育时期及其突变体花朵关键发育时期的转录本及启动子序列进行差异分析，结合前期对羊踯躅花瓣色素代谢规律的研究结果，关联研究色素变化趋势与基因差异表达的关系，初步获得调控羊踯躅花瓣黄色性状形成的候选基因。采用cDNA末端快速扩增技术(RACE)分离关键基因的全长，通过荧光定量PCR和RNA原位杂交技术研究关键基因在不同组织及花器官不同发育时期的表达差异，进一步利用转基因技术进行基因功能验证。研究结果拟挖掘出调控羊踯躅花瓣黄色性状形成的关键因子，初步阐明羊踯躅花色形成的分子机制，为杜鹃花定向培育黄花新品种奠定基础。

羊踯躅是杜鹃属植物中极少数开金黄色花的物种，是培育黄色杜鹃新品种的珍稀种质资源，挖掘其花色形成的关键因子具有重要的理论和现实意义。本研究以羊踯躅花器官不同发育阶段花瓣为材料，采用高效液相色谱法对羊踯躅花瓣中的叶黄质、玉米黄质、α-胡萝卜素和β-胡萝卜素进行分离分析，发现羊踯躅在花蕾期有大量类胡萝卜素积累。β-胡萝卜素在花发育过程中，其含量远高于α-胡萝卜素、叶黄质和玉米黄质；β-胡萝卜素随着花的发育，其含量先降后升，在盛开期达到最高，表明β-胡萝卜素是影响羊踯躅花瓣着色的一个主要因素，其含量变化与羊踯躅的花色形成密切相关。以羊踯躅叶片为材料，成功建立了羊踯躅叶片再生体系，为杜鹃转基因育种奠定基础。以羊踯躅不同组织为材料，利用qRT-PCR技术对ACT7、UBC、TUB、ACT5、RPL3、NAC、FAD、EF1-γ、EF1-α、18S和GAPDH基因的表达量进行分析，获得理想的内参基因RPL3和EF1-α。采用RNA-Seq技术分析羊踯躅成花诱导过程中基因表达差异，发现差异基因主要富集于类胡萝卜素代谢通路。差异基因在羊踯躅花发育早期高表达，表明类胡萝卜素代谢与羊踯躅的花色形成密切相关。克隆获得PSY、PDS、LYCB和CHYB基因的全长序列，分别进行生物信息学分析，并且对其在羊踯躅不同花发育时期的表达量进行分析，发现PSY、PDS、LYCB和CHYB基因在羊踯躅整个花发育阶段均有表达。PSY在膨大期的表达量最高；PDS、LYCB基因在初花期达到最高；CHYB基因在盛花期表达量最高，表明PSY、PDS、LYCB和CHYB基因表达与羊踯躅花色形成模式基本一致，很可能是调控羊踯躅花色形成的关键基因。构建PSY、LYCB和CHYB植物表达载体，并转化烟草，获得转基因植株。转PSY基因烟草植株花色变淡，转LYCB和CHYB基因的烟草植株花色加深。HPLC测定不同转基因株系中类胡萝卜素的含量变化，发现转基因植株的类胡萝卜素含量均高于烟草对照植株；类胡萝卜素的含量变化与目标基因的表达差异基本一致。