水稻冷激蛋白基因OsCSP2的耐盐功能及其作用机制研究

Salt stress is an important environmental constraint limiting the productivity of rice worldwide. The cloning of salt tolerance related genes and better understanding their mechanisms in response of rice to salt stress is necessary to make the best use of saline soils. OsCSP2, a salt-induced rice cold shock protein was separated and identified from Shanyou 10 seedlings, a salt-tolerant hybrid variety, by proteomic techniques. Treatment with NaCl could induce OsCSP2 expression in Shanyou 10 seedlings.Over-expression of OsCSP2 could enhance salt tolerance in transgenic rice.In this project,an attempt will be made to study the gene and promoter expression profile and subcellular location of OsCYP2, and investigate activity of antioxidant enzymes in transgenic plants under salt stress. On this basis,co-immunoprecipitation and yeast two-hybrid system will be used to identify interacting proteins with OsCSP2. The possible mechanisms of OsCSP2 involved in conferring salt tolerance will be preliminarily discussed. Implementation of the project is very important to elucidating the mechanism of abiotic stress tolerance and improving abiotic stress tolerance in crops.

盐胁迫已成为限制水稻生长、发育和产量最严重的非生物胁迫之一。挖掘水稻耐盐相关基因并研究其功能,具有重要的理论意义和广泛的应用价值。本课题组通过蛋白质组技术在耐盐水稻"汕优10号"中发现水稻冷激蛋白OsCSP2与耐盐相关，盐分胁迫能诱导该基因的上升表达；利用转基因技术表明该基因的超量表达能提高水稻的耐盐性。本项目拟通过分析基因表达、启动子时空表达模式、蛋白亚细胞定位、抗逆生理生化指标检测等方面研究，明确OsCSP2在水稻抗盐分胁迫中的功能；同时，利用酵母双杂交和免疫共沉淀筛选鉴定互作蛋白（基因），解析OsCSP2基因介导的耐盐信号网络，分析该基因的耐盐作用机制。项目的实施对于阐明水稻抗盐分胁迫的调控机理以及育种改良具有重要意义。

冷激蛋白是广泛存在于生物体中的一种高度保守的应激蛋白。冷激蛋白在植物抵抗高盐、低温、干旱等多种逆境胁迫中发挥重要作用。通过克隆水稻冷激蛋白基因OsCSP2并对其在高盐胁迫应答中的功能进行分析，可为阐明该基因在逆境胁迫下的分子作用机制奠定基础，为水稻耐盐品种改良提供新的基因源。.利用组织化学染色和荧光定量PCR研究了OsCSP2基因启动子的时空表达模式。生物信息学分析该启动子序列发现其存在大量与低温、高盐、干旱等逆境胁迫响应相关顺式作用元件。对启动子融合GUS的转基因水稻组织化学染色和荧光定量PCR检测结果证实了该启动子受低温及高盐诱导的调控特性。在正常条件下OsCSP2启动子能驱动下游基因在水稻根、茎、叶、叶鞘、颖壳、种子等组织中进行低水平表达，而低温和高盐逆境条件能显著增强该启动子的启动能力。.用实时荧光定量RT-PCR的方法分析OsCSP2基因在水稻不同组织以及不同逆境胁迫下的表达量。该基因在水稻的根、茎、下部叶、叶鞘、剑叶及穗等不同组织中均有表达，但是在各个组织的表达水平并不完全一样，在叶片及叶鞘中表达量相对较低，其中叶鞘中最低，而在茎和穗中表达量较高。OsCSP2基因在高盐、低温、高温胁迫下都能增强表达，但对不同胁迫的响应模式不完全相同。而20%PEG处理对其表达影响不大。以绿色荧光蛋白GFP为报告蛋白，确定OsCSP2蛋白定位于细胞核和细胞膜上。.超量表达OsCSP2基因，可以显著提高水稻发芽期、苗期以及成株期的耐盐性，并增强植株SOD酶活性及脯氨酸含量，降低MDA含量。而RNA干扰抑制其表达后植株表型无显著差异。.利用酵母双杂交方法筛选到5个可与OsCSP2结合的互作蛋白。它们分别为金属硫蛋白4A(LOC4352580)、E3 泛素连接酶 RBBP6(LOC4348695) squamosa 启动子结合蛋白1 (LOC4325162)、类枯草杆菌蛋白酶 SBT3.17 (LOC4338887)和未知蛋白(LOC4335882)。荧光定量RT-PCR的方法分析表明LOC4348695、LOC4325162和 LOC4338887的表达受高盐胁迫诱导。但它们在水稻耐盐胁迫应答中的功能要需要进一步研究。