示踪鼠疫菌构建及其感染小鼠后免疫反应机制研究

在研究鼠疫菌致病机制的过程中，我们通过质粒消除的策略，获得了鼠疫菌201株4个毒力质粒不同缺失组合的15种减毒鼠疫菌。为了研究鼠疫菌感染小鼠的免疫反应机制，本项目基于15种含不同质粒组合的减毒鼠疫菌、201野生株、EV76活疫苗株，构建携带双色荧光蛋白的可示踪鼠疫菌。免疫动物后分离细胞，通过共聚焦显微镜观察中性粒细胞、DC细胞和巨噬细胞对不同鼠疫菌株的吞噬情况，流式细胞仪分别测定中性粒细胞、DC细胞和巨噬细胞对不同鼠疫菌吞噬能力；测定DC细胞、巨噬细胞、CD4+T和CD8+T细胞的激活情况以及CD4+T和CD8+T细胞产生细胞因子情况和不同株鼠疫菌引起中性粒细胞、DC细胞和巨噬细胞的凋亡情况。综合分析测定结果，分析不同毒力的鼠疫菌在体内引起免疫反应的差异，阐明鼠疫菌毒力强弱、不同质粒缺失与免疫反应的关系，揭示宿主感染鼠疫菌后免疫反应产生的机制。

本研究基于鼠疫菌不同质粒缺失突变株，构建了携带绿色荧光蛋白和生物发光质粒luxCDABE的示踪鼠疫菌。将这些示踪鼠疫菌感染BALB/c小鼠后，分离巨噬细胞，然后测定了诱导后巨噬细胞对不同质粒缺失突变株的吞噬能力。结果表明，各突变株对巨噬细胞的吞噬能力有不同影响，而且各突变株在巨噬细胞中的繁殖能力也不相同。缺失pMT1的突变株201-pPCP1+-pCD1+-pCRY+引起显著的IFN-γ分泌，表明pMT1质粒对IFN-γ的分泌有抑制作用。只含pCD1质粒的突变株也引起IFN-γ分泌的增加，表明这个质粒促进IFN-γ分泌。然而，同时含有pMT1和pCD1质粒的鼠疫菌不引起IFN-γ分泌的明显增加，表明pMT1对IFN-γ的分泌有抑制作用。.基于luxCDABE 生物发光质粒构建了Y. pestis 201, Y. pestis 201-pCD1+, Y pestis 201-pMT1+, Y. pestis 201-pPCP1+, Y. pestis 201-pCRY+, Y. pestis 201-p¯ and Y. pseudotuberculosis Pa36060生物发光克隆株，并以小鼠为原发性败血症动物模型，通过活体成像技术测定了这些克隆株在此模型中的传播。这些质粒缺失突变株主要定居在肝、脾。Y. pestis 201-pMT1+似乎具有较强的在肝、脾和血液中存活能力，并且其毒力也强于其它质粒缺失突变株。Y. pestis 201-pPCP1+ 似乎比其它质粒缺失突变株具有较强的定居肺脏的能力。假结核菌Pa36060 在肠和肺的定居能力最强，鼠疫菌 Y. pestis 201野生株在血液中的存活能力最强，其毒力也最强。这些结果表明质粒pMT1是与肝、脾和血液定居相关的重要毒力决定子，而pPCP1质粒似乎与肺定居相关。血液存活能力是与毒力相关的重要因素。