三价砷甲基转移酶基因AS3MT对三氧化二砷所致APL患者砷代谢能力下降和肝脂肪变性的影响及机制研究

Arsenic trioxide (ATO) has gained great progress in the treatment of acute promyelocytic leukemia (APL) combined with all-trans retinoic acid, and has become front-line agent. However, the adverse effects, particularly the chronic toxicity and potential carcinogenicity caused by ATO are still the main concerns. Although studies have proved no retension of total arsenic after the cessasion of ATO, little report or systematic investigation is taken into the metabolism and chronic toxicity among patients. Our previous work showed that after the cessation of ATO, the methylation capability of some APL patients is injured, revealing a high incidence of hepatic steatosis, which was associated with the single nucleotide polymorphisms (SNPs) of arsenic (+3 oxidation state) methyltransferase gene (AS3MT), a key gene in charge of the methylation metabolism and detoxication of inorganic arsenic in human body. On the basis of previous studies, this project is aimed to survey the impact of SNPs in AS3MT on the changes of AS3MT amount (measured by mRNA and enzymes) and function (measured by the methylation index of arsenic), to discover the mechanisms of hepatotoxicity under oxidative stress, as well as the hepatic steatosis, to elucidate its relationship with injured methylation capability, to evaluate the risk of hepatic steatosis by monitoring dynamic changes in arsenic methylation index, and to assess the protective effect of recombinant human AS3MT, thus improving the safety of ATO as front-line therapy for APL.

三氧化二砷(ATO)联合全反式维甲酸(ATRA)治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)取得了突破性进展，成为APL的一线用药。但ATO的毒副作用，尤其是慢性毒性和潜在致肿瘤作用仍倍受关注。虽有研究证实应用ATO后体内无长期总砷蓄积，但有关患者体内的砷代谢和慢性毒副作用尚缺乏报道和系统研究。我们前期工作发现ATO治疗后部分患者的砷甲基化代谢能力下降，致肝脂肪变性问题较突出，与人体内无机砷甲基化代谢解毒的关键基因——三价砷甲基转移酶基因(AS3MT)的单核苷酸多态性(SNPs)相关。本研究拟在前期工作的基础上观察AS3MT基因SNPs对AS3MT酶的表达量(mRNA、酶定量)和酶功能(砷甲基化指数)变化的影响，揭示肝细胞氧化应激损伤、肝脂肪变性的机制，及其与砷甲基化能力下降之间的关系，监测砷甲基化指数判断发生肝脂肪变性的危险性，探索重组人AS3MT的保护作用，提高ATO作为APL一线用药的安全性。

三氧化二砷(ATO)和全反式维甲酸(ATRA)联合治疗使急性早幼粒细胞白血病(APL)成为第一个可被治愈的白血病，但ATO的毒副作用及潜在致肿瘤风险阻碍了其成为APL一线用药。化学、毒理学领域已证明，高毒性的无机砷在肝脏中经+3价砷甲基转移酶(AS3MT)甲基化代谢，可变为低毒性的有机胂排出体外，但ATO静脉使用下的解毒代谢过程和毒副反应尚无系统研究。. 前期工作中我们发现，112例已停药的APL患者中，有42.9%发生肝脂肪变性，其尿砷一甲基化指数（PMI）较无病变者明显降低（P=0.027），说明ATO可能导致患者慢性肝损，与砷甲基化指数有关。. 在前期基础上，课题组首先完成了停药患者及对照者的砷检测工作，发现停药6个月后患者体内便无明显总砷蓄积，但尿液中的无机砷比例明显高于健康对照（P<0.001）。提示ATO接触会影响患者对砷的甲基化解毒代谢能力，导致总砷不超标的情况下仍有相对较多的无机砷蓄积。同时体外研究表明，无机砷引起的肝细胞氧化应激和肝细胞凋亡远大于有机胂。. 进一步对停药患者进行基因分析，发现AS3MT基因的单核苷酸多态性（SNPs）可影响个体对砷的甲基化代谢能力。在18个已报道的SNPs中，有2个SNPs（A9749G和A27215G）的野生型（AA）的尿砷二甲基化指数（SMI）均明显低于突变型（AG和GG）。说明突变型患者的砷甲基化能力提高。这两个SNPs都位于AS3MT基因的内含子上，在本研究的基础上或可进一步明确这两个SNPs的功能。. 最后进行动物实验，通过AS3MT基因敲除小鼠和野生型小鼠的比较，证明了缺乏AS3MT酶时砷PMI明显降低（P=0.004），即砷解毒代谢能力降低。转氨酶和肝脏病理检查也证实了AS3MT基因敲除小鼠更易发生急慢性肝损。加入重组AS3MT可部分逆转慢性肝脂肪变性，但对急性肝损无明显改善。说明AS3MT或可弥补SNPs差异带来的代谢能力不足，但短期高浓度药物接触引起的急性损伤仍无法解决。. 本研究证实了AS3MT SNPs、砷甲基化指数和急性肝损、慢性肝脂肪变性之间的相关性，临床中可通过监测患者的SNPs、PMI、SMI来进行早期预测和干预，推动ATO成为APL治疗的一线用药。