新一代高通量DNA测序技术在肿瘤miRNA/mRNA差异表达分析中的应用方法研究

miRNAs和mRNA共同构成了一个重要的基因调控网络，在动物发育、细胞分化及代谢中起着重要的作用。近期的研究表明它们还与肿瘤的发生有着极其重要的关联。了解miRNAs与mRNA之间在正常组织和肿瘤组织中表达差异的密切关系将在癌症的发生、诊断和治疗中带给我们一些重要线索。本项目利用新一代高通量测序仪，发展一种多样本测序文库构建方法，结合我们已有的生物信息学分析平台，对4种不同肿瘤样本及正常样本的miRNA 和mRNA同时进行全基因组范围的表达差异分析，利用传统的荧光定量PCR方法进行验证，试图更全面地寻找与肿瘤发生相关的新的miRNA，用以阐明miRNA在调节各种基因的表达水平与肿瘤发生的关系，筛选特定miRNA作为肿瘤的早期诊断标志物、恶性评估及预后的判断指标等，并可以用于筛选能够控制瘤生长的生物小分子药物。本课题研究在肿瘤分子生物学、功能基因组学及生物医药领域具有广泛的应用。

在国家自然基金面上项目的资助下，我们开展了以下几点工作：1）针对SOLiD测序平台在miRNA表达谱分析中存在的问题，提出了一种生物信息学数据处理的补偿方法，为进一步有效校正多重匹配问题提供理论依据；2）改进基于SOLiD测序平台的miRNA测序文库的制备方法，与商业化的文库制备方法相比，接头二聚体水平得到很大程度的降低；3）发展了一种双标签编码的高通量测序miRNA文库制备方法，结果表明本方法是一种理想的可以在高通量测序平台中实现对大量样本的并行分析的样本制备方案；4）基于项目发展的文库制备方法对对32个乳腺癌相关样本进行miRNA的差异表达研究，通过大规模测序实验，我们共发现22种miRNA在乳腺癌肿瘤组织样本组和良性组织样本组之间呈现差异性的表达；5）利用TNF-a处理的不同时间点肝癌细胞HepG2和正常肝细胞HL-7702为研究对象，同时进行了miRNA和mRNA的表达谱差异分析和关联分析，我们发现随着时间的作用，有5个mRNA的表达随着TNF-α作用时间延长一直上升，而有6个mRNA的表达则一直下降，在miRNA表达谱分析中我们发现4个miRNA随着TNF-α作用时间延长其表达量呈现一直下降的趋势，进一步分析显示在TNF作用细胞时，它们形成相互作用的网络，导致肿瘤细胞的死亡，抑制肿瘤发展；6）依据第5部分的关联分析结果，在全基因组范围内分析miRNA与NF-кB家族因子相互作用关系，预测了2个miRNA-Rel/NF-кB前向反馈调控循环对，即NFKBIA hsa-mir-196b/ Rel/NF-кB和hsa-mir-219-1/ Rel/NF-кB，对于与TNF-α对细胞的作用机制相印证还需要进一步的实验验证。