肝再生增强因子特异性结合短肽的筛选和抗肝癌的实验研究

肝再生增强因子（ALR）是近年发现并克隆的一种能促进损伤肝脏修复的细胞因子。在我们对它的系列研究中,不仅发现它在肝癌细胞中高表达,正常肝细胞不表达，而且也证明它以自分泌方式在维系肝癌细胞恶性增殖中起了很重要的作用。同时还发现它有很强的免疫调控作用，这提示它在肝癌的免疫逃逸中也起了重要作用。用特异性单抗中和其分泌，用siRNA在转录水平抑制其表达，均能明显抑制肝癌细胞增殖和移植瘤在裸鼠体内生长，这说明它可以作为肝癌治疗的新靶点。但是单抗作为异种蛋白限制了它在临床上应用，而siRNA要导入肝癌细胞中才能发挥其抑制作用。因此，本研究拟从噬菌体随机短肽库中筛选出能与肝再生增强因子特异性结合的短肽，并通过实验证明此特异性结合短肽能阻断肝再生增强因子的促肝癌细胞增殖作用，为肝癌的治疗寻找新的靶向药物，也为进一步研究肝再生增强因子的免疫调控作用，提供阻断工具。

结题摘要.主要结果和成果：（1）完成了ALR表达、纯化和鉴定；完成了ALR单抗大量制备；完成了用ALR筛选噬菌体随机十二肽和七肽库。从十二肽和七肽库中分别筛选出能与ALR结合的噬菌体46个和19个。经测序和序列比对，发现十二肽库的阳性噬菌体中4#，13#，15#和17#插入序列完全一致，而14#克隆插入序列与这4个克隆只相差一个碱基。1#，6#，8#，9#，10#，11#，16#和17#共8个克隆显示有相同的插入序列。来自七肽库中的19个克隆插入序列互不同相，也与十二肽库筛出的克隆不同。从两组具有相同插入序列的噬菌体中各选一个既15#和16#，用ELISA方法进一步验证结合的特异性，结果15#能以剂量依赖方式结合。合成15#和16#肽的氨基酸序列及其对照序列。对照序列氨基酸组成相同，但排列不同。用HepG2和QGY肝癌细胞证明15#能以剂量依赖方式阻断ALR的促癌细胞增殖的作用，15#对照肽和16#及其对照肽均无此作用。裸鼠成瘤实验也证明，注射15#肽的裸鼠肿瘤生长速度明显慢于注射对照肽的裸鼠；实验结束时，肿体积和重量在两组间有明显差异。用BABL/C小鼠检测15#肽和对照肽的免疫原性，隔天注射一次，连续一月，实验结束时未检测到有抗体产生。用酶学和常规病理方法检测了心、肝、肾等，均未发现明显变化。现正在申请专利。（2）观察ALR特异性结合肽能否抵消ALR对免疫细胞的抑制作用，这部分没能按期预期研究计划完成，目前仍在研中。（3）此部分研究计划中没有，但是对阐明ALR免疫抑制的靶细胞及相关机制有帮助。证明了ALR能抑制ConA刺激的PBMC增殖，却不抑制刺激的T细胞增殖，提示ALR通过影响PBMC中其它细胞来实现免疫抑制作用。ALR也没能明显改变ConA刺激的PBMC中各细胞的比例，但它能使ConA刺激的PBMC中Treg细胞的百分比明显升高。ALR能解除ConA导致的Treg细胞G2/M期阻滞，有利于Treg细胞增殖分化。ALR也使ConA刺激的PBMC上清中的IL-10浓度升高，IL-2浓度降低，而起到免疫抑制作用。ALR可明显抑制ConA诱导的PBMC早期凋亡，因此ALR不通过凋亡途径来起免疫抑制作用。部分结果已发表SCI论文1篇。培养博士2名（1名在读），硕士2名（1名在读）。