应用短肽阵列和噬菌体展示技术筛选尘螨变应原特异性IgE结合表位的研究

特异性IgE抗体是Ⅰ型超敏反应发生的主要效应分子，最新研究表明：用变应原表位肽检测患者血清IgE，其含量与患者病史、临床过敏程度等有更好的相关性。尘螨是室内变应原最重要的来源，在国家自然科学基金和省自然科学基金资助下，我们已经成功建立尘螨变应原多种组份的原核表达体系。在此基础上，本次申请课题旨在建立基于短肽阵列和噬菌体展示文库的免疫学分析技术筛选尘螨变应原特异性IgE结合表位：根据尘螨变应原主要组份Der f 1、Der f 2和中等效价组份Der f 4、Der f 5、Der f 7的氨基酸序列设计并合成短肽构建微阵列，以尘螨过敏性哮喘患者血清一次性筛选出各组分顺序表位；制备5种变应原组份单克隆抗体，依次筛选噬菌体展示文库获得其构象表位。研究有望同时获得尘螨变应原多种组份的顺序表位和构象表位，为尘螨过敏疾病性诊断、预后及免疫治疗新型制剂的研发提供科学依据，为抗原表位研究提供新的思路。

变应原特异性IgE是临床诊断Ⅰ型超敏反应性疾病的重要标志物，其表位肽结合的特异性IgE含量与患者病情轻重、临床过敏程度密切相关。尘螨是室内最重要的变应原来源物之一，其粗提浸液中有30多种成份可与过敏性哮喘患者血清IgE发生结合，粉尘螨变应原第1、2组分Der f 1、Der f 2为主要组分，第4、5、7组分Der f 4、Der f 5、Der f 7为中等效价组分。本研究在实验室内人工培养粉尘螨，提取总RNA，根据GenBank中公布的核酸序列设计引物或简并引物，PCR扩增和RACE试验分别获得Der f 1、Der f 2、Der f 4、Der f 5和Der f 7全长基因，根据测序结果推导出各组分氨基酸序列，设计并合成短肽（8肽，重叠7肽）、构建微阵列，用筛选获得的阳性血清进行芯片扫描试验，共获得线性表位21个；分别构建各组分原核表达质粒，表达、纯化后用SDS-PAGE、Western blotting和质谱验证表达产物；用纯化出的重组蛋白免疫小鼠，成功制备、纯化出各组分多克隆抗体；针对多抗中的IgE抗体，应用噬菌体展示文库（Ph. D TM-12 Phage Display Peptide Library, NEB）进行筛选，将筛选出的阳性克隆进行ELISA检测、测序，共获得构象表位13个。这些表位为进一步开发尘螨相关Ⅰ型超敏反应性疾病诊治策略奠定了基础，并为抗原表位分子研究提供了新的思路。